Методы ПЦР в диагностике онкологических заболеваний
1.4 Mеханизмы ПЦР. Стадии постановки ПЦР
Вся методика базируется на способности нуклеиновых кислот к самостоятельной репликации, что в данном случае проводится искусственно в условиях лаборатории. Воспроизведение ДНК может начаться не в любой области молекулы, а только в участках с определенной последовательностью нуклеотидов -- стартовых фрагментах. Для того чтобы полимеразная цепная реакция началась, нужны праймеры (или ДНК-зонды). Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий:
Наличие в реакционной смеси ряда компонентов:
Праймеры - олигонуклеотид, выполняющий роль затравки и инициирующий синтез полинуклеотидной цепи на ДНК- или РНК-матрице. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.
Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) - "строительный материал", используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК;
Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, и стабильное значение рН;
Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, служащую мишенью для последующего многократного копирования (например, ДНК микроорганизмов) [14].
Циклический температурный режим:
Ход реакции: обычно при проведении ПЦР выполняется 20--35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий:
1. Денатурация. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95° С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. Этот процесс длится не менее 1 минуты.
2. Отжиг. На втором этапе температуру смеси понижают до 55°С праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры выбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.
Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.
3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы - 75°С, и начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3-гидроксильной группой праймера, с максимальной эффективностью.
Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.
Первый цикл. ДНК-мишень фланкирована определенными последовательностями. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу Tag и четыре дНТФ. Здесь каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3-гидроксильной группы "её" праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру.
Во втором цикле двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной ("длинная матрица") цепей, вновь денатурируют, а затем отжигают с праймерами [13].
В третьем цикле все гетеродуплуксы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплецируются. При отжиге праймеры гибридизуются с комплементарными участками исходных цепей, а также "длинных" и "коротких" матриц.
В последующих циклах число "коротких матриц" становится все больше.
Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.
Эффект «плато»
Используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации. В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта “плато” влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента) и др.
Стадии постановки ПЦР:
Подготовка пробы биологического материала
Амплификация
Приборное обеспечение
Детекция молекул РНК
Оценка результатов реакции
Метод горизонтального электрофореза
Метод вертикального электрофореза
Метод гибридизационных зондов
Контроль за прохождением реакции амплификации [12]