2. Выделение ДНК из венозной крови
Перед выделением ДНК необходимо приготовить рабочий раствор солевого буфера. Для этого Содержимое флакона с 10-кратным Солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96% этиловым спиртом довести до метки 300 мл и перемешать. Готовый рабочий раствор Солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4?С. Солевой буфер необходим для дальнейшей промывки осадка с ДНК.
Выделение ДНК проводят в специализированном боксе для выделения. Необходимо соблюдать правила техники безопасности:
- руки должны быть защищены одноразовыми перчатками, которые утилизируются после выделения;
- дыхательные пути защищены одноразовой маской, которая также подлежит утилизации после использования;
- лаборант во время выделения должен быть одет в специальный халат, шапочку и очки.
Все манипуляции с исследуемым материалом проводят при соблюдении правил работы с вирусами III и IV группы. Постановку ПЦР осуществляют как минимум в 3 рабочих зонах:
Зона 1 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка ПЦР-реагентов.
Зона 2 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка проб и контролей, выделение ДНК, внесение проб в пробирки с ПЦР-реагентами, проведение амплификации.
Зона 3: детекция амплифицированной ДНК.
Пробы из зоны 3 запрещено переносить в зоны 1 и 2 во избежание контаминации ДНК-матрицей. Пипетки или наконечники должны иметь аэрозольный барьер. Перчатки и халаты необходимо менять при переходе из одной зоны в другую.
Оборудование, необходимое для выделения ДНК:
- ламинарный бокс или стерилизуемое УФ-излучением помещение;
- одноразовая пластиковая посуда (стерильные пробирки типа "Эппендорф" объемом 1,5; 0,5; 0,2 мл);
- автоматические пипетки объемом от 0,5 мкл до 1 мл;
- сменные одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами;
- центрифуга типа "Эппендорф" с охлаждением и скоростью не менее 10000 g;
- встряхиватель ("Вортекс");
Выделение ДНК из венозной крови проводят в несколько этапов:
1. В пробирку объёмом 1,5 мл внести 300 мкл исследуемой пробы, добавить 800 мкл Лизирующего реагента и перемешать содержимое пробирки переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется. Лизирующий реагент необходим для разрушения клеток крови и экстракции из них ДНК.
2. Термостатировать пробирку со смесью 5-7 мин. При температуре 65?С. Если выделение ДНК проводится из твёрдого сухого мелкоизмельчённого материала, то следует термостатировать 30-40 мин.
3. После термостатирования центрифугировать пробирку со смесью 10 сек при 5000 об. в мин., в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворённый осадок. Прозрачный супернатант целиком перенести в чистую пробирку.
4. В пробирку с чистой смесью добавить 45 мкл суспензии сорбента NucleoSTM. Перед использованием NucleoSTM следует интенсивно перемешать до гомогенной суспензии на вортексе. NucleoSTM необходим для того, чтобы на его частицах осела выделенная из клеток ДНК.
5. Пробирку поместить на ротатор и перемешивать 10 мин (10-20 об/мин) для лучшего оседания выделенной ДНК на частицах кремния.
6. Центрифугировать 10 сек при 5000 об. в мин.
7. Осторожно, не задевая осадок, удалить супернатант с помощью водоструйного насоса.
8. К осадку добавить 400 мкл Лизирующего реагента, тщательно перемешать на вортексе до полного гомогенного состояния. Если супендирование затруднено (при большой нагрузке ДНК) из-за слипания сорбента, то его необходимо вначале суспендировать наконечником пипетки, а затем на вортексе.
9. Добавить в пробирку 1 мл рабочего раствора Солевого буфера и перемешать содержимое переворачиванием пробирки 5-10 раз.
10. Центрифугировать 10 сек при 5000 об. в мин.
11. Осторожно удалить супернатант, не задевая осадок, с помощью водоструйного насоса.
12. Повторить промывку дважды Для этого необходимо добавлять по 1 мл Солевого буфера, перемешивать содержимое пробирки на вортексе, центрифугировать 10 сек. при 5000 об. в мин. и удалять прозрачный супернатант.
13. Просушить осадок при температуре 65?С в течение 3-4 мин.
14. В эту же пробирку внести 300 мкл ЭкстраГена ЕТМ, который необходим для отделения промытой ДНК от частиц кремния. ЭкстраГен ЕТМ следует отбирать от общего объёма при постоянном перемешивании.
15. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 сек до получения гомогенной суспензии, затем термостатировать 4-5 мин при 65?С.
16. Ещё раз суспендировать содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием. Центрифугировать 1 мин при 10000 об. в мин.
17. Перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку. ДНК хранить при температуре -20?С.