2.5 Проведение полимеразной цепной реакции

Принцип тестирования основывается на экстракции РНК или ДНК возбудителя из плазмы крови совместно с внутренними контрольными образцами и проведении ПЦР - амплификации ДНК/кДНК с гибридизационно - флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Выявление микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно - флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа:

1. экстракция (выделение) нуклеиновой кислоты из образцов клинического материала;

2. амплификация фрагмента ДНК или РНК данного возбудителя;

3. гибридизационно - флуоресцентная детекция, которая производится либо непосредственно в ходе ПЦР, либо после ее завершения.

Экстракция ДНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца, который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами ДНК или РНК проводится реакция амплификации фрагмента нуклеиновой кислоты выявляемого возбудителя при помощи специфичных к нему праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно - меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК/РНК - мишени , в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. К олигонуклеотидным зондам, специфичным к различным ДНК/РНК - мишеням, прикреплены различные флуоресцентные метки. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации каждой ДНК/РНК - мишени путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по соответствующему каналу. Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени». По одному из каналов регистрируют накопление продукта амплификации участка ДНК/РНК возбудителя, а по другому - накопление продукта амплификации ДНК/РНК внутреннего контрольного образца.