In vivo может быть использована для определения степени напряженности
антитоксического иммунитета в организме человека (пробаШика).
Реакция флоккуляции (РФ) - используется для титрования
антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов. В реакции
флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При
смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксической
сывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Механизм РФ
сходен с таковым реакции преципитации.
В реакциях нейтрализации и флоккуляции участвуют в качестве компонентов
токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки).
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Разработана А. Кунсом и носит
его имя (метод Кунса). Это один из методов исследования, в котором
используются меченные антитела. В качестве метки используется краситель,
дающий свечение в ультрафиолетовых лучах (изоцианат флюоресцеина или
просто флюорохром). Риф используется в двух модификациях: прямой
метод Кунса и непрямой метод Кунса. Прямой метод: исследуемый
материал, зафиксированный на предметном стекле, обрабатывается меченой
флюорохромом диагностической сывороткой; обязательный этап реакции –
отмывка от непрореагировавших антител; если в исследуемом материале есть
искомый антиген, меченные антитела фиксируются на антигене и после
отмывки такой комплекс выявляется по свечению при просматривании
препарата под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод: в этом
случае реакция идет в два этапа – на первом этапе используется немеченая
диагностическая сыворотка, на втором этапе используется меченая
флюорохромом антиглобулиновая сыворотка; с помощью непрямого метода
можно выявлять в исследуемом материале как наличие антигена, так и
наличие и титр специфических антител.
Люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки представляют собой
иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые
флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих
сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной
сыворотки флюорохромов путем прочной химической связи. Люминес
цирующие сыворотки используют при постановке РИФ.
Антиглобулиновые сыворотки (АГС) содержат антитела к иммуног-
лобулинам сыворотки человека или кролика - в зависимости оттого, какая
иммунная сыворотка используется в реакции. АГС получают путем
иммунизации животных иммуноглобулинами человека или кролика. Такие
сыворотки используют для постановки непрямой РИФ, реакции ИФА, реак-
ции Кумбса.
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для; 1) серологической диагностики инфекционных заболеваний 2) идентификации бактерии и др. микробов. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем: 1) Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным; 2) Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.
Компоненты реакции: 1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 «С в течение 30 минут); 2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов); 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5) 3 % взвесь эритроцитов барана, 6) физиологический раствор; 7) контрольная сыворотка.
Комплемент, В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) во многом напоминает РИА, но включает использование коммерческих реагентов — Аг или AT, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды в жёлто-коричневый (при использовании псроксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).
По сравнению с классическими методами выявления Аг, иммуноферментный анализ ( ифа ) позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие Аг с AT в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия — агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность — обычно достаточно присутствия Аг в концентрации I нг/мл. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики.
Наибольшее распространение получил гетерогенный иммуноферментный анализ ( ифа ) на твёрдой фазе (твердофазный ИФА). Для этого коммерческие моноклональные AT или Аг фиксируют на лунках пластиковых панелей, куда затем вносят исследуемый материал (содержащий Аг или AT).