11.2. Утилизация крахмала и Сахаров

Крахмал - основной резервный полисахарид растений, представ­ляющий смесь гомополимеров D-глюкозы как линейных (амилоза), так и разветвленных (амилопектин). Крахмал широко используют в пище­вой промышленности и пивоварении, при этом его сначала гидролизу-ют до низкомолекулярных компонентов, затем превращают в другие соединения, преимущественно во фруктозу и этанол. Основные фер­менты, необходимые для гидролиза крахмала и дальнейших превраще­ний, - а-амилаза, глюкоамилаза и глюкозоизомераза, стоимость кото­рых составляет около 30% общей стоимости ферментов, применяемых в настоящее время в промышленности. Промышленное производство фруктозы и этанола из крахмала - многоэтапный процесс, включающий ферментнативные и неферментативные стадии (рис. 23).

1. Желирование молотого зерна (содержание крахмала примерно 40%) проводится паром под давлением, в результате разрушаются крахмальные зерна и храхмал становится доступен для последующего ферментативного гидролиза. Полученный продукт имеет желеобразную консистенцию.

2.Ожижение желированного крахмала заключается в его охлажде­нии до 50-60 °С и добавлении а-амилазы, под влиянием которой гидро-лизуются доступные а-1,4-связи с образованием низкомолекулярных полисахаридов. Высокая температура повышает эффективность про­никновения фермента в желированный крахмал и увеличивает скорость гидролиза.

3. Осахаривание (полный гидролиз) низкомолекулярных полисаха­ридов (как линейных, так и разветвленных) происходит под действием глюкоамилазы.

Конечным продуктом такой переработки является глюкоза, из кото­рой с помощью дрожжевой ферментации получают этанол или при уча­стии глюкозоизомеразы - фруктозу, а-амилазу можно выделить из мно­гих микроорганизмов, для промышленных целей ее обычно получают из Bacillus amyloliquefaciens, глюкоамилазу также синтезируют многие микроорганизмы, но обычно ее получают из грибов Aspergillus niger.

Стоимость производства этанола и фруктозы из молотого зерна, в основном, определяется стоимостью ферментов, используемых однократно. Поэтому разработка недорогого широкомасштабного производ­ства этих ферментов существенно снижает стоимость конечных про­дуктов; для этих целей используют:

• разновидности а-амилазы (встречающиеся в природе или соз­данные методом генной инженерии), обладающие более высо­кой активностью, позволяющие проводить ожижение при 80-90 °С, это ускоряет гидролиз желированного крахмала, эконо­мит энергию, расходуемую на охлаждение до температуры, при которой идет гидролиз;

• модифицированные гены а-амилазы и глюкоамилазы, чтобы контролируемые ими ферменты имели одинаковые оптимумы температуры и рН, позволяющие совместить этапы ожижения и осахаривания;

• клонированные бактериальные гены, кодирующие ферменты -термостабильные, обладающие высокой каталитической актив­ностью, устойчивые к действию этанола.

Сбраживание субстрата при промышленном производстве этанола осуществляется в основном S. cerevisiae, но более рационально исполь­зовать Zymomonas mobilis, грамотрицательную палочку, сбраживаю­щую глюкозу, фруктозу, сахарозу с относительно большим выходом этанола.

Для расширения спектра утилизируемых Z. mobilis субстратов, бы­ли выделены и экспрессировны в Z. mobilis чужеродные гены (фермен­тов, гидролизующих лактозу, крахмал, целлюлозу, ксилозу, целлобиозу, пентозу), в частности ген глюкозо/ксилозоизомеразы и ксилулокиназы -ферментов, необходимых для утилизации ксилозы. На следующем этапе в Z. mobilis имплантировали плазмиду, несущую два оперона, один из которых кодировал два фермента, метаболизирующих пентозу. Затем эти два оперона встраивали в челночный вектор Е. coli - Z. Mobilis, ко­торые трансформировали Z. mobilis. Трансформированные клетки ути­лизировали ксилозу и перерабатывали пентозы до этанола, причем про­дуценты эффективно росли, используя в качестве источника углерода побочные продукты деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности.

При переработке растительного материала образуется большое ко­личество лигноцеллюлозных отходов, годовое производство их огром­но, поэтому идет интенсивный поиск эффективных способов фермента­тивного расщепления. Комплекс лигноцеллюлозы подвержен совместному действию целлюлолитических микроорганизмов только после предварительной обработки сильной кислотой или щелочью, или высо­кой температурой под давлением, что существенно сказывается на стоимости конечного продукта.

Целлюлазные гены (эндо- и экзоглюканаза, (3-глюгазидаза, целло-биогидролаза, целлобиза) клонировали и экспрессировали в Е. coli или другие микроорганизмы и получали новые штаммы с полезными свой­ствами. Так, S. cerevisiae и Z. mobilis, эффективно преобразующие в этанол простые сахара, после введения им целлюлозных генов могли превращать целлюлозу непосредственно в этанол.

Целлюлазы возможно использовать для промышленной биоперера­ботки бумажных отходов в этанол. Для этого отходы частично расщеп­ляли целлюлазами при 45 °С, затем, не удаляя целлюлаз, проводят фер­ментацию высвободившейся глюкозы S. cerevisiae при 37 °С. Этот под­ход позволяет получить 400 л этанола из 1 т бумажных отходов, ис­пользуя его в качестве топлива, экономя, примерно, 16% бензина.

Созданы штаммы Lactobacillus plantarum, способствующие более эффективному образованию силоса из сельскохозяйственных культур, которые содержат много крахмала, например люцерны.

Белок одноклеточных организмов (БОО) - этот термин принят для белковых продуктов, синтезируемых монокультурой Methylophilus methylotrophus (в качестве основного субстрата эти бактерии использу­ют метан) на некоторых видах биомассы (целлюлозные отходы, про­дукты переработки нефти). Предполагалось, что БОО можно использо­вать в качестве пищевых добавок или корма для скота благодаря высо­кому содержанию метионина, лизина, витаминов, микроэлементов. Производство БОО оказалось экономически нецелесообразным по при­чинам высокой стоимости получаемых продуктов, сомнительного вку­сового качества и токсичности. Для того чтобы разработать экономич­ный процесс производства БОО из отходов, необходимо изучить кине­тику роста, метаболизма, возможность генетического манипулирования и безопасность многих микроорганизмов.