Молекулярно-генетические методы исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза

дипломная работа

2.2.2 Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

Пробирка MGIT 960 содержит модифицированную бульонную основу 7H9.Примерная формула содержит следующие компоненты на 1000 мл дистиллированной воды:

- модифицированная бульонная основа Мидлбрук 7H9 - 5,9 г

- казеиновый пептон - 1 ,25 г.

Формула корректируется с возможным внесением добавок в зависимости от функциональных требований. На дне пробирки имеется помещенный в силикон флуоресцентный датчик. Пробирку во время наполнения промывают 10% CO2, затем закрывают полипропиленовой завинчивающейся крышкой. Крышку открывать следует только в случае необходимости внесения каких-либо веществ в среду.

Для системы BACTEC MGIT 960 предусмотрена ростовая добавка MGIT(MGIT Growth Supplement. Добавку необходимо добавлять в пробирку MGIT до инокуляции пробы. В состав ростовой добавки MGIT на 1 000 мл дистиллированной воды входят:

-бычий альбумин 50,0 г

-декстроза 20,0 г

-каталаза 0,03 г

-олеиновая кислота 0,1 г

-полиоксиэтилена стеарат 1,1 г

Для снижения риска контаминации используется смесь антибиотиков PANTA, которая вносится в пробирку MGIT до инокуляции проб вместе с обогатительной добавкой. Каждый флакон MGIT PANTA (для MGIT 960) содержит лиофилизированную смесь антибактериальных препаратов со следующей концентрацией на момент изготовления:

-полимиксин B 6,000 ед.

-амфотерицин B 600 мг

-налидиксовая кислота 2,400 мг

-триметоприм 600 мг

-азлоциллин 600 мг

Процедура подготовки пробирок MGIT и посев образца.

a. Разведение лиофилизированной добавки PANTA

* Растворить PANTA (добавку с антибиотиками для подавления роста посторонней флоры) в 15 мл обогатительной добавки MGIT Growth Supplement, добавив ее во флакон с PANTA. Оставить на 15 минут.

* Добавить 0,8 мл полученного раствора в каждую пробирку MGIT непосредственно перед посевом материала.

* Все манипуляции проводить в ламинарном боксе II- класса защиты.

b. Посев в пробирку MGIT

Все этапы работы должны выполняться только в ламинарном боксе II- класса защиты.

* Внимательно осмотреть пробирку MGIT и убедиться, что она пригодна для работы (наличие силиконового кольца на дне пробирки, объем жидкости - 7 мл, крышка плотно закрыта).

* Написать на пробирках идентификационные лабораторные номера.

* С помощью стерильной одноразовой пипетки внести 0,5 мл ресуспендированного осадка в подготовленною пробирку MGIT и 0,1-0,25 мл в пробирку с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена.

* Закрыть немедленно после внесения плотно крышку пробирки и аккуратно несколько раз перевернуть пробирку, чтобы перемешать содержимое.

* Обработать снаружи пробирки и пробки дезсредством, поместить пробирки в штатив и оставить на 30 минут при комнатной температуре.

* Для исключения перекрестной контаминации и поддержания оптимальной концентрации углекислого газа в пробирках, всегда необходимо открывать только одну пробирку на минимально возможное время.

с. Меры предосторожности

Основным источником контаминации среды MGIT являются микроорганизмы из окружающей среды, попавшие в пробирку во время внесения добавок и материала, поэтому необходимо соблюдать следующие правила:

1. Все добавки вносить только в ламинарном боксе II-класса защиты.

2. Не открывать несколько пробирок одновременно.

3. Открывать пробирку MGIT на максимально короткое время.

4. При внесении ростовой добавки рекомендуется пользоваться дозатором.

5. Всегда плотно закручивать крышку. Если она сидит неплотно, могут возникнуть сложности с детекцией флуоресценции.

6. Проба, внесенная в пробирку объемом более 0,5 мл, может повлиять на показатель pH среды и вызвать ложную флуоресценцию, а также может усилить контаминацию.

d. Инкубация

Все засеянные пробирки MGIT необходимо поместить в прибор. Протокол исследования на автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 -6 недель.

Температура инкубации для микобактерий туберкулеза + 37°С, допустимые колебания температуры от + 35°С до +38°С. В процессе инкубации встряхивание и перемещение пробирок запрещено.

е. Детекция положительного роста

О появлении положительной пробирки прибор сообщает появлением красной индикации на наружной панели соответствующего ящика и значка «+», а также звуковым сигналом.

При наличии индикации о положительном результате необходимо открыть указанный ящик; нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки»; извлечь пробирку из указанной прибором ячейки; считать штрих-код извлеченной пробирки.

Следует просмотреть пробирку и визуально определить наличие роста микобактерий. Обычно в жидкой среде микобактерии растут в виде своеобразной «зернистости» или белых хлопьев, при этом прозрачность среды может почти не меняться. Как правило, рост микобактерий сосредоточен на дне пробирки. Сильное помутнение среды может свидетельствовать о наличии контаминации посторонней флорой.

Максимальное время инкубации пробирок в приборе MGIT - 42 дня. Пробирки, в которых размножение микобактерий не зафиксировано прибором в течение указанного времени, идентифицируются системой как отрицательные. В этом случае прибор сообщает появлением зеленой индикации на наружной панели соответствующего ящика и звуковым сигналом. Для того чтобы извлечь «отрицательные» пробирки, необходимо открыть соответствующий ящик и нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки» - прибор укажет зеленым световым сигналом на те пробирки, которые необходимо удалить. Необходимо извлечь пробирку из ячейки и отсканировать штрих-код, а также просмотреть пробирку, пытаясь визуально определить наличие возможного роста микобактерий и контаминации (мутность, дисперсность и т.д.)[13].

Делись добром ;)