2.2.3 Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видо микобактерий из культурального материала

Выделение ДНК

Исходным материалом для теста могут быть бактерии, выросшие как на плотной среде (Левенштайна-Йенсена, Миддлбрук), так и в жидкой (например, BACTEC, MB-check). Тест не подходит для детекции микобактерий из прямого материала пациентов. Рабочая площадь должна быть чистой от амплифицированной ДНК. Решающим моментом является нагревание образцов до 95°C в течение 20 минут, чтобы обеспечить полный лизис клеток и инактивировать вегетативные бактерии. Можно применять любые методы выделения ДНК, позволяющие получить амплифицируемую ДНК из бактерий. Следующий краткий протокол позволяет получить ДНК, подходящую для амплификации:

1а. При работе с бактериями, выросшими на плотной среде, петлей отобрать бактерии и суспендировать в примерно 300 мкл воды (вода должна быть пригодна для молекулярно-биологических исследований).

1б. При работе с бактериями, выросшими на жидкой среде, в работу берётся 1 мл. Бактерии осаждают при центрифугировании в течение 15 мин при 10000g в стандартной настольной центрифуге с аэрозоль-непроницаемым ротором в ламинарном боксе II класса. Супернатант слить, а бактерии ресуспендировать на вортексе в 100-300 мкл воды.

2. Инкубировать бактерии из пп. 1а и 1б на водяной бане 20 минут при 95°C.

3. Обработать пробу в ультразвуковой бане в течение 15 мин

4. Центрифугировать пробу на максимальной скорости 5 мин, и использовать 5 мкл супернатанта для ПЦР. Если предполагается более длительное хранение, то раствор ДНК необходимо перенести в новую пробирку.

Амплификация

Подготовить амплификационную смесь (по 45 мкл) в чистой от ДНК комнате. Образцы ДНК следует вносить в пробирки в отдельном помещении.

Микс на одну пробирку:

- 35 мкл PNM - поставляется в наборе

- 5 мкл 10-кратного полимеразного буфера для инкубации - не поставляется

- х мкл раствора MgCl21) - не поставляется

- 1-2 единицы термостабильной ДНК-полимеразы (см. данные изготовителя) - не поставляется

- у мкл воды для доведения объёма до 45 мкл (без учета объема фермента) - не поставляется

- Добавить 5 мкл раствора ДНК (20-100 нг ДНК) для получения конечного объема 50 мкл (без учета объема фермента)

1) В зависимости от используемой системы фермент/буфер, оптимальная концентрация MgCl2. может варьировать между 1.5 и 2.5 мМ.

Обратите внимание, что некоторые инкубационные буферы уже содержат MgCl2. Конечная концентрация MgCl2 в этой амплификационной смеси составляет 2.5 мM.

Определяется количество образцов для амплификации (количество анализируемых проб + контрольные образцы). Проба контроля контаминации, например, содержит 5 мкл воды вместо раствора ДНК. Подготовить мастер-микс, содержащий все реактивы, за исключением раствора ДНК, и хорошо перемешать (не на вортексе). Аликвотировать по 45 мкл в каждую подготовленную ПЦР-пробирку.

Программа амплификации2:

15 мин 95°C 1 цикл

30 сек 95°C

2 мин 58°C

25 сек 95°C

40 сек 53°C 20 циклов

40 сек 70°C

8 мин 70°C 1 цикл

2) Относительно Taq полимеразы, использованной для валидации: если применяется определённая hot start ДНК-полимераза, время, необходимое для первого этапа нужно сократить. Продукты амплификации могут храниться при температуре от +4 до -20°C. Для проверки реакции амплификации, можно нанести 5 мкл каждого образца прямо на 2% агарозный гель без добавления буфера.

Длина ампликонов составляет примерно 230 пар оснований (Контроль Рода) и до 200 пар оснований (Универсальный Контроль/видоспецифичный фрагмент) соответственно[14].

Гибридизация. Подготовка

Предварительно прогреть водяную баню с шейкером(рис. 3) до 45°C. Максимально допустимое отклонение температуры ±1°C. Растворы HYB м STR нужно предварительно прогреть до 37-45°C. В реагентах не должно быть осадка (при этом обратите внимание, что раствор CON-D опалесцирует). При необходимости перемешать растворы. За исключением CON-C и SUB-C, довести остальные растворы до комнатной температуры. В подходящей пробирке разведите концентрат коньюгата (CON-C - оранжевый) и концентрат субстрата (SUB-C - жёлтый) в соотношении 1:100 с соответствующим буфером (CON-C с CON-D, SUB-C с SUB-D) в необходимом количестве. Хорошо перемешайте и доведите до комнатной температуры. Из рассчёта на каждый стрип: добавьте 10 мкл концентрата к 1 мл соответствующего буфера. CON-C разводится перед каждым использованием. Разведенный SUB-C можно хранить 4 недели в защищенном от света месте при комнатной температуре.

Рис. 3 Термошейкер.

1 Внесите по 20 мкл денатурирующего раствора (DEN, голубого цвета) в угол каждой ячейки.

2. Добавьте в раствор по 20 мкл продукта амплификации, перемешайте пипетированием и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. В это время пинцетом выньте стрипы из тубы и подпишите их карандащом под цветной полосой. Со стрипами работать только в перчатках!

3. Осторожно добавьте в каждую ячейку 1 мл предварительно нагретого гибридизационного буфера (HYB, зеленого цвета). Аккуратно покачивайте ванночку до получения гомогенного окрашивания. Следите, чтобы раствор не попал в соседние ячейки.

4. Поместите стрипы в ячейки.

Стрипы должны быть полностью погружены, а рабочая сторона (определяемая по цветной полосе на нижнем конце) должна быть лицом вверх. Если стрип перевернулся, его нужно поправить пинцетом. Во избежание контаминации тщательно мойте пинцет после каждого применения. Это важно и на всех последующих этапах теста.

5. Поместите ванночку на водяную баню с шейкером и инкубируйте 30 мин при температуре 45°C. Установите скорость встряхивания водяной бани так, чтобы жидкость постоянно перемешивалась, но не попадала в соседние ячейки. Чтобы установить равномерное распределение температуры, ванночку погружают на 1/3 высоты.

6. Полностью аспирируйте Гибридизационный Буфер. К примеру, можно использовать пастеровскую пипетку, соединенную с вакуумным насосом.

7. Добавьте 1 мл Раствора для Жесткой Промывки (STR, красного цвета) в каждый стрип и инкубируйте 15 мин при 45°C в водяной бане с шейкером.

8. Далее работайте при комнатной температуре.

Полностью удалите раствор для жесткой промывки. Вылейте моющий раствор в контейнер для отходов, а остатки жидкости удалите похлопыванием ванночки по фильтровальной бумаге. Таким же образом поступайте и при следующих этапах отмывки.

9. Отмойте каждый стрип в 1 мл Промывающего Раствора (RIN) в течение 1 мин на платформе шейкера (слейте RIN после инкубации).

10. Добавьте по1 мл разведенного конъюгата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте 30 мин на платформе шейкера.

11. Удалите раствор и промойте каждый стрип дважды по 1 мин в 1 мл промывающего раствора (RIN) и один раз 1 мин примерно в 1 мл дистиллированной воды (используйте флакон для промывки) на платформе шейкера. После последней промывки тщательно удалите все остатки воды.

12. Добавьте 1 мл разведенного субстрата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте без встряхивания, защищая от света. В зависимости от условий теста (например, температуры в комнате), время субстратной инкубации может варьировать от 3 до 20 мин. Слишком длительная инкубация может привести к избыточному развитию окраски фона, и, тем самым может способствовать неправильной интерпретации результатов.

13. Остановите реакцию кратким двукратным промыванием дистиллированной водой.

14. Пинцетом удалите стрипы из ванночки и высушите их между двумя слоями фильтровальной бумаги[15].