Синтез и процессинг proBNP

BNP человека синтезируется в виде препрогормона, состоящего из 134 АК. Молекула preproBNP человека содержит гидрофобную сигнальную последовательность, состоящую из 26 аминокислотных остатков, которая отщепляется котрансляционно в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме до окончания синтеза С-концевой части молекулы прогормона. Молекулы proBNP (108 аминокислотных остатков) подвергаются дальнейшему процессингу с образованием физиологически неактивной N-концевой части (NT-proBNP) и биологически активной молекулы BNP (Рис. 3). Было показано, что в плазме человека присутствуют три формы пептида: BNP, proBNP и NT-proBNP [6]. Предполагают, что расщепление proBNP происходит в кардиомиоцитах либо непосредственно в момент секреции, либо перед секрецией в кровоток. Однако до конца этот вопрос не изучен.

Рис.3

Экспрессия гена proBNP характерна как для миоцитов предсердий, так и для миоцитов желудочков сердца человека [21]. Однако миоциты предсердий и желудочков значительно отличаются друг от друга по принципу хранения и секреции пептидов. В миоцитах предсердий присутствуют секреторные гранулы, содержащие как интактные молекулы proBNP, так и продукты расщепления молекулы предшественника. Миоциты желудочков сердца, напротив, не содержат таких гранул и продуктов расщепления proBNP. С другой стороны, есть некоторые данные о том, что при заболеваниях сердечно-сосудистой системы в желудочках также образуются секреторные гранулы, и в ткани присутствуют продукты расщепления proBNP. Кроме того, показано, что фибробласты сердца также синтезируют BNP [22]. Клетки коронарной сосудистой сети также экспрессируют ген BNP, по крайней мере, при коронарном атеросклерозе [23].

В работе [24] было показано, что основная часть иммунореактивного BNP, циркулирующего в крови больных с тяжелой стадией СН представляет собой proBNP. Как на эндотелиальных, так и на клетках гладких мышц сосудов было показано, что молекула proBNP обладает в 6-8 раз меньшей физиологической активностью по сравнению с BNP. Однако механизм, приводящий к увеличению содержания непроцессированной формы proBNP в кровотоке больных с тяжелыми формами СН до сих пор остается неясным. Процессинг proBNP в сердце до сих пор остается слабо изученным. Одной из основных причин этого является отсутствие хороших клеточных моделей in vitro. Неонатальные миоциты могут быть выращены в культуре в течение короткого периода времени, однако при этом не происходит их дифференцировка в зрелые клетки предсердий и желудочков [21].

Предполагают, что proBNP расщепляется эндопротеазой фурином, поскольку при СН показано одновременное увеличение экспрессии генов фурина и BNP. Кроме того, proBNP содержит мотив Arg-X-X-Arg в положении 73-76 АК, по которому происходит расщепление молекул предшественника фурином. Также было показано, что при ингибировании фурина in vitro процессинг proBNP блокируется [21].

Фурин является наиболее изученной протеазой, осуществляющей процессинг молекул предшественников. Ген фурина человека был установлен в 1989 году [25]. Этот ген был впервые охарактеризован как ген, ассоциированный с протоонкогенами c-fes/feps. Дальнейшее клонирование полной кДНК и экспрессия помогли установить гомологию фурина и Kex2 (субтилизиновая конвертаза).

Фурин является трансмембранным белком, представляющим собой кальций-зависимую сериновую протеазу с субтилизин-подобным доменом. Фурин экспрессируется повсеместно во всех тканях человека. С широкой распространенностью фурина в организме человека связана широкая специфичность данного фермента. Так, известны такие субстраты как факторы роста, гормоны, рецепторы клеток, факторы свертывания крови, металлопротеиназы, экстраклеточные белки, секретазы, бактериальные токсины и гликопептиды вирусов. Фурин присутствует в нескольких компартментах клетки, таких как транс-Гольджи сеть, эндосомы, плазматическая мембрана [25].

Также как и бактериальный субтилизин фурин синтезируется в форме зимогена (профермент), который превращается в активную форму фермента при протеолитическом отщеплении N-конца молекулы. Было показано, что фурин проходит две стадии расщепления, зависящие от рН [27]. В кардиомиоцитах предсердий BNP хранится в виде секреторных гранул, и секретируется при необходимости в ответ на внешние сигналы. proBNP может подвергаться расщеплению фурином в ТГС и затем храниться в предсердных секреторных гранулах. В желудочках, напротив, секреторных гранул не образуется, и proBNP, по-видимому, расщепляется непосредственно при выбросе в кровоток. Процессинг proBNP происходит более интенсивно в предсердиях, чем в желудочках. Так, отношение BNP/proBNP для предсердий и желудочков составляет 2:1 и 1:1, соответственно. Однако после инфаркта миокарда соотношение BNP/proBNP в желудочках составляет 3:1, что объясняется усилением экспрессии фурина в кардиомиоцитах.

В ткани сердца была обнаружена и охарактеризована также другая эндопротеаза -- корин. Корин является сериновой протеазой, способной проводить протеолитическое расщепление in vitro proANP и proBNP [26]. Корин содержит трансмембранный домен, локализованный в мембране клетки, поэтому предполагается, что расщепление молекулы предшественника происходит в момент секреции гормона в кровоток. Таким образом, существует предположение, что корин может участвовать в процессе расщепления молекулы proBNP на BNP и NT-proBNP в ткани сердца. С другой стороны в настоящее время не существует данных о том, где происходит расщепление молекулы proBNP корином. Кроме того, процессинг proBNP и proANP в клетках предсердий различны. Так, показано, что секреторные гранулы предсердий содержат молекулы proANP и BNP [21]. Таким образом, активность корина не объясняет в полной мере процессов, приводящих к появлению физиологически активных молекул натрийуретических пептидов.

Корин является протеазой, осуществляющей процессинг ANP. При проведении точечных мутаций по 98, 101 и 102 Arg молекулы корина процессинга proANP не происходило, что позволяет предполагать, что корин-опосредуемый процессинг proANP обладает высокой специфичностью. В предыдущих исследованиях было показано, что корин является высокомолекулярной сериновой протеазой кардиомиоцитов. Было показано, что корин относится к типу II трансмембранных трансмембранных белков с внеклеточным каталитическим доменом.

Известно, что для образования активной формы корина, осуществляющего процессинг предшественников НП, необходимо отщепление пептида от первоначально синтезируемой молекулы фермента [27]. Однако до настоящего времени неизвестно, какая протеаза участвует в активации корина. в нормальном состоянии только небольшое количество корина находится в активном состоянии в кардиомицитах. При повышении давления, возможно, увеличивается активность протеазы, активирующей корин, и образуется необходимое количество активного корина, осуществляющего процессинг proANP. Корин является гликопротеидом. Также было установлено, что гликозилирование корина относится к N-типу. Причем гликозилирование корина имеет важное значение для процесса его активации.