2.4.2 Стрептомицин

Мальтольный метод

Этим методом возможно определение не только стрептомицина, но и маннозидстрептомицина. Он основан на том, что оба названных антибиотика при нагревании с раствором разбавленной щёлочи образуют мальтол, который определяется затем колориметрически или спектрофотометрически по окраске, образуемой им с солями железа или реактивом фолина.

В мерную колбу на 25 мл наливают 10 мл испытуемого образца стрептомицина-основания, содержащего 0,5 мл антибиотика и 1 мг раствора. В эту же колбу добавляют 2 мл 1 N NaOH и ставят её на кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охлаждают колбу в ледяной или проточной водопроводной воде и приливают 2 мл 1,2 N HCl; добавляют 5 мл 0,25% хлористого железа и доводят общий объём смеси дистиллированной водой до метки.

Полученный окрашенный раствор калориметрируют при 550 нм в соответствующем фотоэлектрокалориметре против раствора стандартного образца антибиотика и дистиллированной воды в контролях.

Результаты выражают графически на полулогарифмической сетке, где по оси ординат откладывают значения для степени прохождения света, а по оси абсцисс ? концентрацию стрептомицина. Активность испытуемого образца вычисляют по стандартной кривой.

Недостатки метода: нельзя определять стрептомицин и маннозидстрептомицин отдельно при нахождении их в смеси; если в последней будет ещё и оксистрептомицин, то он в условиях опыта даст оксимальтол, который также образует окрашенные продукты с солями железа.

Нитропруссидный метод

Этим методом можно определять различные стрептомицины, так как известно, что нитропруссид натрия в щелочной среде даёт окрашивание с гуанидином.

Определение выполняется следующим образов: смешивают равные объёмы 10% растворов нитропруссида натрия, железистосинеродистого калия и едкого натра. К смеси приливают 3 объёма воды. Через 30 мин раствор готов к употреблению (он имеет ярко-жёлтую окраску). При появлении мути в растворе его заменяют свежим. Обычно реактив пригоден для работы лишь в течение нескольких часов.

К 5 мл раствора стрептомицина (концентрация 20-25 Ед/мл) приливают 1 мл реактива. При этом возникает устойчивая оранжевая окраска. Раствор калриметрируют против раствора стандартного образца стрептомицина (контроль). Последний должен быть прозрачным, поскольку мутные растворы могут исказить результаты определения.

Метод не вполне специфичен, так как окрашенные соединения получаются и с другими веществами, содержащими гуанидиновые группы, и, в частности со стрептидином ? продуктом расщепления стрептомицина, не обладающим биологической активностью.

Микроманометрический метод

Метод применим для определения низких концентраций антибиотика (0,005-0,05 ЕД/мл).

В сосудики от аппарата Варбурга вносится взвесь 16-18-часовой культуры золотистого стафилококка 209Р (25-100 млн. клеток/мл), мясо-пентонный бульон без NaCl и глюкозы; рН среды 8,0. Объём смеси в каждом сосудике должен быть равен 2 мл. В центральную часть сосудика наливают 0,2 мл 1 N раствора NaOH. Температура водяной бани ? 37?. Стрептомицин используется в концентрациях от 0,005 до 0,05 ЕД/мл. При этом между количеством поглощённого бактериями кислорода и концентрацией стрептомицина существует прямолинейная зависимость. Измерение дыхания проводят в пределах 2,5 ч с интервалом измерений объёма поглощённого кислорода через каждые 15-30 мин. По результатам опытов строят стандартную кривую, на основании которой производят расчёт активности в испытуемом образце. Для этого по оси ординат откладываколичество (мм3) поглощённого кислорода за 2,5 ч, а по оси абсцисс ? концентрацию антибиотика (ЕД/мл).

Следует отметить, что растворы стрептомицина более высокой концентрации, чем 0,05 ЕД/мл, необходимо предварительно разбавлять до концентрации 0,005-0,05 ЕД/мл или определять другими методами.

Микроманометрическое определение пригодно для выявления концентрации стрептомицина в негемолизированной крови (гемолизированная кровь убивает стафилококка).