Список сокращений

GSH - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

NOS - NO - синтаза

АФК - активные формы кислорода

АТФ - аденозинтрифосфат

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МАО- Моноаминоксидаза

НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

ТАТ-тирозинаминотрансфераза

ПОЛ-перекисное окисление липидов

ВВЕДЕНИЕ

Исследования, посвященные адаптационным возможностям человека и животных, являются актуальними на сегодняшний день. Реакция организма на действие стрессора зависит от индивидуальных особенностей нервной системы. В этой связи, метаболизм в условиях стресса необходимо исследовать с учетом индивидуальных особенностей животных, которые зачастую выражаются в поведенческих реакциях организма [19]. В последние десятилетия широкое признание завоевала точка зрения, согласно которой устойчивость организма к действию физических и эмоциональных стресс-факторов определяется индивидуальным набором антистрессовых защитных механизмов. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе индивидуальной устойчивости, до настоящего времени изучены недостаточно [11].

Рабдомиолиз - разрушение миоцитов с выходом миоглобина в кровь, что приводит к накоплению больших количеств свободного гема в крови и его поступлению в органы и ткани. Избыток свободного гема усиливает образование активных форм кислорода с последующим окислительным повреждением биомолекул [37]. Об усилении окислительных процессов в тканях после введения глицерола могут свидетельствовать результаты определения содержания свободных SH-групп, входящих в состав белковых и небелковых соединений. Оксидативный стресс способствует мобилизации защитных систем организма и адаптации метаболизма в экстремальных условиях. Это обусловлено также и активацией нейрогуморальной регуляции при нарушении гомеостаза, о чем может свидетельствовать индуцибельная форма тирозинаминотрансферазы, содержащаяся в печени, индукция синтеза которой происходит при повышение содержания в крови глюкокортикоидов.

В связи с этим, целью данной работы является изучение состояния тиол-дисульфидного статуса и активность тирозинаминотрансферазы при рабдомиолизе у животных с различным эмоциональным статусом, а также изучение эффектов L-Аргинина в условиях рабдомиолиза.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.1 Тирозинаминотрансфераза (ТАТ) E.C.2.6.1.5

ТАТ катализирует реакцию трансаминирования тирозина и перевода его в парагидроксифенилпировиноградную кислоту.

L-тирозин+2-оксоглутарат=4=гидроксифенилпируват+ L-глутамат

ТАТ представляет собой димер с молекулярным весом 95 kD и локализуется в клетках печени, почек, сердца и не обнаружена в клетках кожи. По времени полужизни ТАТ относится к быстро обновляющимся белкам (время полужизни - 1-24 ч). hTAT людей является пиридоксальфосфат-зависимый фермент и является единственной известной аминотрансферазой, которая различает тирозин и фенилаланин [46].

Адаптивная индукция ТАТ в ответ на воздействие различных факторов, может быть вызвана тяжелыми последствиями, к которым приводит накопление в организме недоокисленных продуктов тирозина, и стремлением организма поддержать оптимальный уровень этой аминокислоты с целью обеспечения широкого спектра участия метаболитов тирозина в осуществлении приспособительных реакций на действие экстремальных факторов.

Фермент обеспечивает поддержание оптимального уровня тирозина в тканях, посредством чего осуществляется регуляция обмена этой аминокислоты. На участие данного фермента в развитии стрессовой реакции организма указывает тот факт, что ТАТ, наряду с триптофанпирролазой, является адаптивным ферментом, довольно быстро реагирующим на изменение концентрации субстрата или гормонального фона в организме, а также на воздействие различных экстремальных факторов внешней среды (Курбанов и др., 1983; Okamoto et al. ,1983; Коваленко, 1984 и др.). Митохондриальная форма фермента индуцируется при гипертермии, вызванной солнечно-тепловым воздействием и гидрокортизоном [27].

1.1.1 Регуляция экспрессии фермента

Одним из широкоизвестных генов, регулируемых гормонами у млекопитающих, является ген тирозинаминотрансферазы. Установлено, что введение гидрокортизона крысам приводит к существенному увеличению скорости транскрипции гена TAT в печени, что, вероятно, является основной причиной увеличения уровня мРНК TAT в этой ткани в индукционный период. Снижение содержания гормона-индруктора гидрокортизона не является единственной причиной уменьшения уровня мPHK TAT в печени крыс. Обнаружено, что ингибитор трансляции циклогексимид увеличивает содержание мРНК TAT в печени крыс, активизируя транскрипцию гена TAT. Ген TAT, помимо печени крыс, экспрессируется и в других тканях (почки, мозг, сердце). В почках, мозге и сердце крыс активность TAT и содержание мРНК не изменяется при введении гидрокортизона. Тканеспецифический характер экспрессии и гормональной регуляции гена TAT у крыс определяется претрансляционными процессами, вероятно, тканеспецифическим характером транскрипции гена TAT [4].

Экспрессия гена белка ТАТ происходит в основном в печени, а именно в гепатоцитах. Уровень экспрессии регулируется посредством нескольких путей передачи межклеточных сигналов, в частности глюкокортикоидами и цАМФ.

Ген ТАТ, состоит из 12 экзонов (A-L экзоны). В 5-фланкирующей области (до -6000 п.н.) гена ТАТ крысы были локализованы 3 тканеспецифических энхансера транскрипции, два из которых взаимодействуют с комплексом глюкокортикоид-рецептор и фактором тканевой специфичности печени HNF3, а третий - с белком, активирующим цАМФ-зависимые сайты (CREB), и фактором тканевой специфичности печени HNF4, т.е. является цАМФ-зависимым (Boshart et al, 1993; Espinas et al, 1994). Знание механизмов регуляции экспрессии гена ТАТ человека имеет, наряду с фундаментальным, важное медицинское значение, поскольку может позволить предотвращать или корректировать нарушения регуляции экспрессии гена ТАТ в процессе онтогенеза, приводящие к тяжелому заболеванию - тирозинемии [16].

Регуляция экспрессии ТАТ осуществляется глюкокортикоидами, инсулином и глюкагоном путем прямой транскрипционной активации гена. Для гена ТАТ крысы в области от -6000 до -2500 п.о. локализованы 2 глюкокортикоидных элемента (GREs), активирующих транскрипцию ( Jantsen H.M.,1987). Эти элементы могут располагаться и в дальних 5-фланкирующих областях. Как правило, на один ген приходится два или более GRE [7].

В фибробластах и других непеченочных клетках ген ТАТ подлежит отрицательному контролю транс-доминирующим тканеспецифическим прекращающим локусом Tse-1. Гепатоцит-специфический энхансер подавляется Tse-1. Две отдаленные последовательности являются абсолютно необходимыми для функции этого энхансера: цАМФ ответный элемент (CRE), который является мишенью для репрессий Tse-1, и гепатоцит-специфический элемент. Специфичность энхансера генерируется сочетанием этих двух основных элементов, которые полностью взаимосвязаны. Tse-1 действует путем связывания с белками, влияющих на CRE. Прямой антагонизм между Tse-1 и цАМФ сигнального пути предполагает, что Tse-1 играет важную роль в контроле развития активации гена ТАТ [29]. Сравнение аналогичных областей генов ТАТ крысы и человекa показало отсутствие протяженных районов высокой гомологии в некодирующих областях (интронах, 3- и 5-фланкирующих районах) этих генов, в то время как общая гомология их экзонов составляет более 75% идентичных нуклеотидов [15].

ТАТ относится к одной из групп ферментов печени крыс, которые впервые появляются в постнатальной печени. Экспрессия ТАТ практически отсутствует у плода; мРНК накапливаеться вскоре после рождения, когда транскрипция генов активируется. Хотя неактивные у плода, ТАТ гены способны экспрессироваться еще ??до рождения. Предполагается, что гепатоциты плода проходят дифференциацию до рождения, что приводит к тому, что ген ТАТ потенциально может экспрессироваться. Отсутствие экспрессии во время беременности, вероятно, объясняется ингибирующим компонентом(ами) маточной среды. Активность ТАТ и синтез мРНК очевидны на первый и последующие дни культивирования гепатоцитов при 19-дневной беременности. Измерения транскрипции в изолированных ядрах показывают, что увеличение мРНК ТАТ в 15 - и 19-дневных гепатоцитах связано с увеличением транскрипции гена. Эти результаты подтверждают предположение, что субпопуляции 15-дневных гепатоцитов плода проходят дифференциацию в культуре по отношению к ТАТ [44].

Экспрессия генов, кодирующих ТАТ и триптофан оксигеназу у крыс, индуцируется в ответ на холодовой стресс. Индукция ТАТ активности у молодых крыс (10 месяцев) примерно в два раза больше той, что наблюдается у старых крыс (25 месяцев). Однако, при измерении скорости транскрипции генов образующейся РНК, никакой разницы обнаружено не было. Эти результаты позволяют предположить, что с возрастом происходят нарушения в пост-транскрипционной регуляции синтеза ТАТ [48].

Обработка клеток гепатомы крысы 500 нг / мл концентрацией N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG) вызвало заметное торможение стероид-индуцибельной экспрессии гена ТАТ. После 1-ч периода обработки с MNNG, добавление 1 мкМ дексаметазона (DEX) в течение 6 и 24 ч привело, соответственно, к уменьшению индукции на 78 и 51%. MNNG мало влияет на базальный уровень активности TAT 6 ч после обработки канцерогеном, но неиндуцированный уровень ТАТ деятельности снизился до 36% от контрольного значения 24 ч после обработки MNNG. Ингибирующий эффект MNNG вызван в притрансляционном периоде [39]. Эффекты актиномицина D (AMD) на внутриклеточный уровень и скорость синтеза TAТ в культуре ткани гепатомы (HTC) клетки - AMD может снизить общий синтез белков и ингибировать деградацию ТАТ и ее мРНК, а также блокирует синтез РНК. Степень этих вторичных действий ингибитора зависит условий роста клеток. Кинетические эксперименты, в которых актиномицина D был добавлен в увеличительных интервалах после дексаметазона, позволяют предположить, что РНК, по-видимому мРНК, накапливается в течение ранней фазы индукции [47].

ТАТ-активность в печени увеличивается при обработке этанолом. Поскольку активность ТАТ увеличивается цАМФ, и этанол повышает цАМФ продукцию с помощью рецепторов аденозин-зависимого механизма, это увеличение в этанол-индуцированной ТАТ активности может произойти через рецепторы аденозин-зависимого механизма [31]. Обнаружение дисульфидной связи обеспечивает некоторое рациональное объяснение относительно ранее наблюдавшейся ТАТ- инактивации при окислительных условиях и реактивации неактивной ТАТ в присутствии восстановителя [38].

1.2 Биологическая роль серосодержащих соединений

Сера - элемент VI группы периодической системы с атомным номером 16. Сера относительно устойчива в свободном состоянии, в обычных условиях находится в виде молекулы S8, имеющей циклическое строение. Природная сера состоит из смеси четырех стабильных изотопов с ат. м. 32, 33, 34 и 36. При образовании химических связей сера может использовать все шесть электронов внешней электронной оболочки (степени окисления серы: 0, 2, 4 и 6) [22]. Сера обеспечивает в клетке тонкий и сложный процесс, как передача энергии: переносит электроны, принимая на свободную орбиталь один из не спаренных электронов кислорода. Сера участвует в фиксации и транспорте метильных групп, является частью различных коэнзимов, включая коэнзим А. Также очень важна детоксикационная роль серы [12].

1.2.1 Серосодержащие соединения

В серосодержащих соединениях обычно кислород замещается на серу, образуя:

Тиопроизводные обладают более сильными кислотными свойствами; некоторые очень токсичны [17].

Наиболее многочисленны соединения S(II), где сера выступает как аналог кислорода. Тиолы или тиоспирты R-S-H представляют собой серосодержащие аналоги спиртов.

1.2.2 Cвойства

Свойство тиолов «гасить» свободные радикалы нашло применение в создании радиопротекторов - веществ, защищающих от радиоактивного излучения. Сераорганические соединения входят в состав многих современных лекарственных средств, среди них самую большую группу образуют сульфаниламидные препараты - производные сульфоновой кислоты. Обладают высокой антимикробной активностью - сульфаниламид, позже получивший название стрептоцид. Известны и S-содержащие лекарственные препараты, которые не относятся к группе сульфаниламидов, например, производное сульфанилмочевины - бутамид стимулирует работу поджелудочной железы, и потому его применяют при лечении диабета [26].

1.2.3 Биологическая роль

Серосодержащие группы, обладая высокой реакционной способностью, входят в состав активных центров гормонов, ферментов, рецепторов. Например, окисление сульфгидрильных групп аденилатциклазы уменьшает, а восстановление -- увеличивает ее активность, что может направленно изменять уровень циклических нуклеотидов, выполняющих функцию вторичных передатчиков в организме. Имеются данные о важной роли сульфгидрильных групп в мышечном сокращении, делении клеток, окислительном фосфорилировании, перекисном окислении, радиационном поражении, нервной деятельности, в частности в нейромедиаторных процессах. Исследования последних лет убедительно свидетельствуют о наличии в a-адренорецепторах и М-холинорецепторах высокореактивных сульфгидрильных групп, а в бета-адренорецепторах и Н-холинорецепторах -- дисульфидных связей, воздействие на которые изменяет рецепторную активность. В современной фармакопее имеется большое количество препаратов, механизм действия которых заключается во взаимодействии с сульфгидрильными группами и дисульфидными связями (блокаторы, тиоловые соединения). Особенно широкий спектр терапевтического воздействия имеют препараты другого химического строения -- тиолы, т.е. соединения, содержащие свободные сульфгидрильные группы. Механизм действия тиолов заключается, во-первых, в их способности разрывать (восстанавливать) дисульфидные связи патологических субстратов и, во-вторых, инактивировать и связывать токсические агенты, а также повышать содержание сульфгидрильных групп в организме. Экспериментальными исследованиями установлено, что дитиолы обладают антиоксидантными свойствами и блокируют реакции перекисного окисления [23].

В организмах животных и человека сера выполняет незаменимые функции: обеспечивает пространственную организацию молекул белков, необходимую для их функционирования, защищает клетки, ткани и пути биохимического синтеза от окисления, а весь организм - от токсического действия чужеродных веществ.В организме человека сера непременная составная часть клеток, активних центров ферментов, гормонов, в частности инсулина, и серосодержащих аминокислот (цистеина, цистина, метионина), биологически активных веществ (гистамина, биотина, липоевой кислоты и др.) [22].

Биологически-активные серосодержащие соединения (БАСС), такие как глутатион, цистеин, метионин, липоевая кислота, содержащие тиоловые (SH-) группы, играют важную роль в физиологических и биохимических процессах в организме человека и животных. Особую роль тиоловым соединениям отводят при рассмотрении их в качестве компонентов неферментативного звена антиоксидантной защитной системы организма наряду с мочевой, аскорбиновой кислотами, различными формами токоферола. Присутствующие в организме тиоловые соединения в первую очередь подвергаются действию активных кислородных радикалов, что предохраняет от их действия функциональные группы биологических молекул и клеточных мембран. Другим важным свойством тиоловых соединений является их способность образовывать комплексные соединения с ионами металлов (Hg2+, Сd2+, Ni2+,Cu2+). Это позволяет защищать организм от токсичного действия «тиоловых ядов». Уровень суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах может выступать в качестве показателя оксидативного стресса и детоксикации организма [8].

1.2.4 Cеросодержащие аминокислоты

В состав белков человека входят 2 аминокислоты, содержащие серу, - метионин и цистеин. Эти аминокислоты метаболически тесно связаны между собой.

Метионин - незаменимая аминокислота. Она необходима для синтеза белков организма, участвует в реакциях дезаминирования, является источником атома серы для синтеза цистеина. Метальная группа метионина - мобильный одноуглеродный фрагмент, используемый для синтеза ряда соединений. Перенос метильной группы метионина на соответствующий акцептор называют реакцией трансметилирования, имеющей важное метаболическое значение.Метальная группа в молекуле метионина прочно связана с атомом серы, поэтому непосредственным донором этого одноутлеродного фрагмента служит активная форма аминокислоты - S-аденозилметионин (SAM) - сульфониевая форма.

Вторая серосодержащая аминокислота - цистеин. Она условно заменима, так как для её синтеза необходим атом серы, источником которого служит незаменимая аминокислота метионин. Для синтеза цистеина необходимы 2 аминокислоты: Серин - источник углеродного скелета; Метионин - первичный источник атома S. Цистеин играет необычайно важную роль в фолдинге белков. При этом 2 остатка цистеина формируют молекулу цистина. Восстановление SH-групп часто происходит с использованием. Глутатион способен существовать в 2 формах - восстановленной (Г-SH) и окисленной (Г-S-S-F) и служит активным антиоксидантом в организме человека. Цистеин также служит предшественником тиоэтаноламинового фрагмента HS-KoA (кофермента А) [21].

1.2.5 Сульфгидрильные группы

Тиоловые группы, SH-группы органических соединений обладают высокой и разнообразной реакционной способностью: легко окисляются с образованием дисульфидов, сульфеновых, сульфиновых или сульфокислот; легко вступают в реакции алкилирования, ацилирования, тиол-дисульфидного обмена, образуют меркаптиды (при реакции с ионами тяжёлых металлов), меркаптали, меркаптолы (при реакции с альдегидами и кетонами). Они играют важную роль в биохимических процессах. Сульфгидрильные группы кофермента, липоевой кислоты и 4-фосфопантетеина участвуют в ферментативных реакциях образования и переноса ацильных остатков, связанных с метаболизмом липидов и углеводов; у глутатиона играют роль в обезвреживании чужеродных органических соединений, восстановлении перекисей и в осуществлении его коферментных функций. В белках эти группы принадлежат остаткам аминокислоты цистеина. В составе активных центров ряда ферментов сульфгидрильные группы участвуют в их каталитическом действии, в связывании субстратов, коферментов и ионов металлов. Каталитическая роль этих групп ферментов заключается в образовании промежуточных соединений с субстратами (или их остатками) или в переносе электронов и протонов от субстратов к акцепторам (в некоторых окислительных ферментах). Блокирование сульфгидрильных групп при помощи специфичных реагентов вызывает частичное или полное торможение активности многих ферментов. Расщепление дисульфидных связей приводит к нарушению нативной структуры белков и утрате ими биологической активности [24].

Существует феномен высвобождения небелковых сульфгидрильных групп (SH-групп) в результате образования иммунных комплексов в реакциях антиген-антитело. По количеству образовавшихся небелковых SH-групп можно оценивать функциональное состояние специфических белков, например, иммуноглобулинов.Свободные небелковые SH-группы в основном находятся в депонированном состоянии, образуя смешанные дисульфидные связи с белками. Появление небелковых SH-групп можно использовать в диагностических целях - для оценки функционального состояния белков острой фазы [12].

Высокая дегенерация в дофаминергических нигростриатных нейроных взрослых самцов WV / WV мышей сопровождается значительными изменениями (тиоловых редокс-состояниях) -TRS и увеличение перекисного окисления липидов в среднем мозге, предполагая участие окислительного стресса в дегенерации дофаминергических нейронов. Они также подтверждают возможности использования тиоловых антиоксидантов для разработки новых нейропротекторных терапевтических стратегий для нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона [41].

1.3 Рабдомиолиз

Рабдомиолиз - это распад мышечных волокон, который приводит к высвобождению содержимого мышечного волокна, миоглобина, в кровь. Освободившиесь продукты распада миоцитов вредны для почек и часто приводят к их повреждению. Когда мышца повреждена, миоглобин поступает в кровоток и фильтруется из организма через почки. Миоглобин распадается на потенциально опасные соединения. Он может блокировать структуры почки, вызывая повреждения, такие как острый тубулярный некроз или почечную недостаточность. Мертвые ткани мышц могут вызвать поступление большого количества жидкости из крови в мышцы, уменьшая объем жидкости в организме и приводя к сотрясению и уменьшению притока крови к почкам. Болезнь может быть вызвана любым условием, которое приводит к повреждению скелетных мышц.

Факторы риска: алкоголизм (с последующими тремором мышц), некоторые наследственные или генетические синдромы, аварии, непереносимость жары, тепловой удар, ишемия или некроз мышц (которые могут произойти с артериальной окклюзией, глубокий тромбоз вен, или другие условия), низкий уровень фосфатов, судороги, тяжелые напряжения, такие как марафон или гимнастика, озноб, травмы, использование или передозировка наркотиков, особенно кокаина, амфетаминов, статинов, героина, относящиеся к медицинским состояниям, таких как диабет или заболевание щитовидной железы, нарушение обмена веществ, таких как кетоацидоз.

Симптомы: Ненормальный цвет мочи (темная, красная), общая слабость, скованность мышц или боль (миалгия), слабость пораженных мышц. Дополнительные симптомы: усталость, боли в суставах, судороги, увеличение массы тела (непреднамеренно) [32].

1.3.1 Биохимия

Первичным диагностическим показателем рабдомиолиза является повышенный уровень креатинфосфокиназы (КФК), по крайней мере в пять раз от нормального значения [43]. Это увеличение, как правило, до такой степени, что инфаркт миокарда и другие причины увеличения КФK исключены. Кроме того, изофермент КФК-ММ преобладает при рабдомиолизе, его содержание составляет по меньшей мере 98% от общего объема [37]. Другое важное открытие, которое часто можно увидеть при рабдомиолизе, - это миоглобинурия. Миоглобин обнаруживается в моче при сывороточной концентрации от 300ng/ml до 2 г / мл и производит видимую пигментурию в концентрациях, превышающих 250 г / мл [42]. Это изменение цвета вызвано миоглобином плюс метмиоглобином в моче. Другие важные биохимические результаты в рабдомиолизе включают гиперкалиемию, гипокальциемию, гиперфосфатемию, гиперурикемию, и повышенный уровень других ферментов мышц, в том числе актатдегидрогеназы, альдолазы, аминотрансферазы и карбоангидразы III (которая является очень специфическим маркером для травм скелетных мышц) [43]. Метаболического ацидоз может возникнуть в результате высвобождения фосфатов, сульфатов, мочевой кислоты и молочной кислоты из мышечной клетки [37].

1.3.2 Этиология

Причинами могут быть: синдром длительного сдавления, электролитные нарушения (гипокалиемия, гипофосфатемия, гипокальциемия, гипонатриемия и в особенности гипернатриемия в сочетании с гиперосмолярностью плазмы), миопатии, полимиозит, дерматомиозит, злокачественная гипертермия, злокачественный синдром при приёме некоторых ЛС (анестетики, фенотиазины, ингибиторы MAO), мышечное напряжение (физическое, вторичное при спастичности или тепловом ударе), травмы, ишемия мышц при окклюзии артерий или сердечно-сосудистой недостаточности, ожоги, повторные повреждения мышц, длительное давление на мышцы, эпилептический статус, инфекционные заболевания, вирусы, бактерии, токсические повреждения мышц, алкоголь, яд змей и некоторых сколопендр (при укусах), монооксид углерода (угарный газ), кокаин, героин, амфетамин, передозировка ЛС, злокачественные новообразования (острая некротическая миопатия опухолей), сахарный диабет.

Причины рабдомиолиза в целом можно разделить на наследственные и приобретенные. Наследственные причины состоят в основном из дефектов ферментов, вызывающих нарушения углеводного обмена, митохондриального липидного обмена [30], и других наследственных заболеваний. Приобретенные причины могут быть разделены на травматические, ишемические, метаболические, инфекционные, воспалительные и токсические [35], а также тренировка и вызванные теплом причины. Токсические - это алкоголь, медикаменты и токсины.

1.3.3 Патогенез

Каким бы ни было повреждение, конечным результатом является повышение клеточной проницаемости для ионов натрия в результате либо нарушения плазматической мембраны или снижение производства клеточной энергии (АТФ) [37]. Внутриклеточный электролитный состав миоцита поддерживается, в основном, за счет активности Na-K-аденозин трифосфатазы (АТФ-азы). Ацетилхолиновые натриевые каналы открываются в ответ на нейрональную стимуляцию в результате инициации деполяризации и развития потенциала действия. При распространении деполяризации по всей длине миоцита внутриклеточный кальций высвобождается из саркоплазматического ретикулума, и ослабляется тропонин-тропомицин-индуцированное подавление соединения актина с миозином. Высвобожденный кальций активно транспортируется обратно в ЭПР, тем самым восстанавливая механизм тропонин-тропомицин-индуцированного подавления актин-миозинового комплекса. В результате такого повторяющегося механизма формируется ответ мышечного волокна в виде сокращений и расслаблений. Так как оксидантный метаболизм является основным источником генерирования АТФ в мышцах, нарушение оксидантно-гликолитических реакций представляет собой важный механизм мышечного повреждения [3].

Накопление натрия в цитоплазме приводит к увеличению внутриклеточной концентрации кальция (который, как правило, очень низкий по сравнению с внеклеточной концентрацией) [43]. Это накопление кальция связано как с прямым повреждением клеток и с увеличением активности Na + / Ca2 + белка транспортера, который приносит больше кальция в клетку, пытаясь удалить избыток натрия. Истощение АТФ также напрямую способствует накоплению кальция в связи с сокращением активности Ca2 + АТФ-азы, которая обычно перекачивает кальций из клетки и изолирует его в ЭПР. Таким образом, общая черта всех патогенетических процессов, вызывающих заболевания рабдомиолиза является резкое увеличение концентрации кальция в цитоплазме и митохондриях в пораженных клетках мышц, который запускает цепь событий, которые в конечном итоге приводият к некрозу клеток мышц. Это включает активацию деградации ферментов, таких как фосфолипаза А2 и нейтральные протеазы, что приводит к повреждениям фосфолипидных мембран и миофибрилл [50]. Джексон и соавт. [34] показывают, что наиболее значимым из них является активация фосфолипазы и что большая часть мембран и митохондриальных повреждений при рабдомиолизе может быть связано с этим. Опосредованный фосфолипазой А аттака фосфолипидов мембран митохондрий и сарколлем приводит к образованию лизофосфолипидов и свободных жирных кислот, которые в дальнейшем могут потенцировать травмы, вызывая прямое повреждение собвстенных мембран и измененяя ионный транспорт, что приводит к дальнейшему притоку ионов натрия и кальция. Таким образом, реакция становится самовоспроизводящейся. Исчерпание АТФ и повреждение митохондрий может быть основным событием, которое запускает этот каскад (как в большинстве наследственных причинах рабдомиолиза) или это можетпроизойти вторично с ростом концентрации кальция. Митохондриальные повреждения и истощения АТФ вносит свой вклад в патогенез через следующее:

1) Повреждение Ca2 + АТФ-азы ведущее к выходу из строя секвестрации кальция и снижению оттока кальция из клетки.

2) Повреждение Na + / K + АТФазы приводящее к увеличению внутриклеточного натрия и увеличению Na +-Ca 2 + обменника, что дает дополнительный вклад в увеличение внутриклеточного кальция.

3) образования токсичных свободных радикалов кислорода, таких как супероксид вызывает дальнейшее повреждение клеток [50].

Локально, накопление этих продуктов может привести к микрососудистым повреждениям, увеличению внутрикомпартментного давления, а также снижению тканевой перфузии и ишемии, которая может еще больше усиливать повреждение мышц. Одной из главных составляющих мышц является предшественник креатинина -- креатин, участвующий в доставке энергии клеткам. Он в больших количествах высвобождается из нежизнеспособных мышечных клеток и трансформируется в креатинин [49].

Деградация миоглобина в канальцах сопровождается высвобождением свободного железа, которое катализирует образование радикалов и тем самым усугубляет почечное повреждение. Даже без высвобождения железа гемоглобина может инициировать перекисное окисление липидов и повреждение почек [33].

1.4 Оксидативный стресс

В организме человека в нормальных условиях 98--99 % молекулярного кислорода подвергается тетравалентному восстановлению в цитохромной системе без образования стабильных промежуточных продуктов: 02+4е" + 4Н+ => 2Н20. Лишь 1--2 % общего количества потребляемого в организме кислорода подвергается одновалентному восстановлению с образованием активных форм кислорода (АФК), т. е. соединений, имеющих неспаренный электрон. К АФК относят супероксидный анион (0~), пероксид водорода (Н202), гидроксильный ион (ОН-) и синглетный (атомарный) кислород.

1.4.1 Основные источники АФК

Это нейтрофилы и другие фагоциты (моноциты, макрофаги, эозинофилы) в процессе активации их функционального состояния. Мембраны названных клеток содержат фермент НАДФ-оксидазу, который способен катализировать процесс восстановления молекулярного кислорода в супероксидный анион (0~), используя в качестве донора электрона НАДФ. В обычном состоянии этот фермент находится в неактивной форме, но при адгезии фагоцитирующих клеток к бактериям или другим поглощаемым субстратам происходит его активация. Образующийся супероксидный радикал переходит в фагосому, формирующуюся при инвагинации мембраны фагоцитирующей клетки, и воздействует на чужеродный объект; к образованию АФК приводит гипоксантин, накапливающийся при гипоксии и утилизируемый при реоксигенации. Процессы образования метаболитов арахидоновой кислоты, в частности простагландинов G, и Н2 (эндопероксидов) и лейкотриенов (ЛтВ4 и др.), а также процессы образования катехоламинов, для которых АФК являются обязательными продуктами реакций. Еще один источник АФК в организме -- это аутоокисление гемоглобина до метгемоглобина с образованием супероксидного аниона; повышает количество АФК, в частности, их неферментативное образование в реакции Хабера--Вейса при взаимодействии супероксидного радикала с пероксидом водорода в присутствии ионов металла с переменной валентностью (железа или меди) или в реакции Фентона при взаимодействии пероксида водорода с двухвалентным железом. В обоих случаях образуется гидроксильный ион.

АФК могут повреждать структуру различных белков и ферментов, что нарушает биокаталитические процессы и оказывать влияние на генетический аппарат клетки, которое заключается в деструктурировании ДНК и нарушении ее синтеза. Однако одними из самых чувствительных к действию свободнорадикальных форм компонентов клетки являются входящие в состав фосфолипидов клеточных и субклеточных мембран ненасыщенные жирные кислоты. Взаимодействие свободных радикалов с полиненасыщенными жирными кислотами приводит к цепным реакциям, известным как реакции ПОЛ. чрезмерная активация ПОЛ приводит к модификации мембранных липидов, уменьшению текучести мембран и мембранного потенциала, к увеличению проницаемости мембран для различных ионов, в частности для Са2+, активирующего многие протеолитические и липолитические ферменты, что существенно нарушает функции клетки и даже может привести к ее гибели. образующиеся при ПОЛ гидропероксиды и продукты их распада обладают цитотоксичностью. Различные химические реакции, с или без ферментативного катализа, генерируют АФК. Антиоксидантная система выступает в качестве «мусорщиков» АФК поддерживая внутриклеточный окислительно-восстановительный статус.

Для защиты клеток от повреждающего действия АФК в них существуют ферментные и неферментные системы инактивации АФК: супероксиддисмутаза; каталаза; глутатионпероксидаза и другие типы пероксидаз; аскорбиновая и мочевая кислоты (восстанавливают водорастворимые свободные радикалы); а-токоферол и (3-каротин (связывают жирорастворимые свободные радикалы); мелатонин (связывает жиро- и водорастворимые радикалы); хелатные агенты -- трансферрин, лактоферрин, церулоплазмин и альбумин (предотвращают катализ свободнорадикальных реакций с помощью металлов переменной валентности) [5].

Ферментные антиоксиданты катализируют реакции, в которых активные формы кислорода и некоторые другие окислители восстанавливаются до стабильных и нетоксичных продуктов.

Супероксиддисмутаза (СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона: О2- + О2- + 2Н+ --> Н2О2 + О2

Образующиеся в супероксиддисмутазной реакции гидропероксид сам является сильнейшим окислителем. Каталаза клетки, локализованная в пероксисомах, не позволяет накапливаться перекиси водорода: Н2О2 --> 2Н2О + О2

Глутатионпероксидаза - использует глютатион для восстановления перекиси водорода и липидных гидроперекисей до нейтральных и малотоксичных соединений.

H2O2 + 2GSH --> GSSG + 2H2O

-LOOH + 2GSH --> GSSG + -LOH + H2O

Разрушая гидроперекиси липидов, глютатионпероксидаза регулирует тем самым продукцию арахидоновой кислоты и уменьшает воспаление. Окисленный глютатион (GSSG) снова восстанавливается глутатионредуктазой: GSSG + НАДФН --> 2GSH - НАДФ+ [28]

Хинон-редуктаза (QR) детоксифицирует соединения хинона, металлотионеины (MT) ловят (тяжелые) катионы металлов, а также витамины С и Е ловят свободные радикалы. Гем оксигеназа катаболизирует свободные структуры гема и ферритиновые молекулы ловят катионы Fe, что ограничивает вредную реакцию Фентона.

Глобальное ингибирование синтеза белка является распространенным ответом на стрессовые условия. Н2О2 вызывает ингибирование инициации трансляции зависимое от Gcn2 протеинкиназы, которая фосфорилирует субъединицы эукариотического фактора инициации-2. Н2О2 вызывает замедление скорости высвобождения рибосом, в соответствии с ингбириующим действием на элонгацию трансляции или терминацию. Высокая концентрация Н2О2 способствует ассоциации полирибосом, но не обязательно приводит к увеличению синтеза белка. Окислительный стресс вызывает комплекс трансляционного перепрограммирования, что имеет основополагающее значение для адаптации к стрессу. Тем не менее, все шире признается, что не вся трансляция подавляется и что трансляционный контроль специфических мРНК необходим для выживания в период роста в условиях стресса. Окислительный стресс в клетках млекопитающих вызывает заметное увеличение фосфорилирования eIF2 и окислительной модификации, которая, как полагают, способствует торможению трансляции. Аттеннюация элонгации рибосом в ответ на стрессовые условия, в отличие от рибосомной инициации, имеет то преимущество, что рибосомы остаются связанными с мРНК и могут быстро возобновить синтез белка при удалении стрессового воздействия или когда обезврежены. Ответная реакция на стресс окружающей среды включает 900 генов, которые транскрипционно активируются или репрессируются большим количеством стрессовых состояний, в том числе такие АФК, как Н2О2. Гены, которые транскрипционно индуцируются в рамках экологической стрессовой реакции кодируют продукты, которые, как считается, защищают от и/или обезвреживают стрессовые агенты, а также репарируют образующиеся клеточные повреждения. Увеличение уровней транскрипции в отсутствие активной трансляции может таким образом служить источником мРНК, которые могут быстро транслироваться как только снимается стресс. С этой точки зрения, мРНК, которые активно транслируются во время воздействия H2O2 могут обеспечить ключевые функции, которые необходимы для детоксикации и удаления Н2О2 и ее продуктов метаболизма. Обработка низким уровнем перекиси приводит к увеличению продукции стресс-защитных белков, в то время как высокие уровни перекиси увеличивают количество рибосом, связанных с определенными мРНК, но не приводит к увеличению продукции белка [45].

Рис.1. Химические реакции, которые генерируют АФК.

Окислительный стресс может изменить гормональную регуляцию. Окисление глюкокортикоидных рецепторов (ГР) in vitro тетратионатом привело к образованию дисульфидных мостиков в белке. Это окислительное ингибирование ГР было обратимо тиол-восстановительным агентом дитиотреитолом. Было показано, что Н2О2 вызывает образование дисульфидных связей между двумя близкими остатками цистеина расположеными в пределах ГР ДНК-связывающих доменов (DBD). Этот эффект был предотвращен предшественником глутатиона N-ацетилцистеином. Крысы, получавшие соединения, полученные из линолевой кислоты (вызывая эндогенный окислительный стресс печени) показали измененный гормональный ответ. В этих условиях гены ТАТ и триптофан-2,3-диоксигеназы показали низкий ответ на глюкокортикоиды. Окислительная модификация тиоловых фрагментов цистеина

Цистеин может претерпевать химические модификации своих тиоловых SH-групп. Атом серы может окисляться АФК или соединениями, содержащими дисульфидные мостики (RS-SR), такие как дисульфид глутатиона. SH ковалентная связь затем заменяется SO или SS ковалентной связью, что приводит к образованию сульфаниловой, сульфиниловой или сульфоновых групп, или дисульфидного мостика соответственно. Эти модификации обратимы при антиоксидантых реагентах, содержащих редуцированную тиоловую группу, такую как дитиотреитол, б-меркаптоэтанол, N-ацетилцистеин или глутатион.

Рис. 2. Окислительная модификация тиоловых фрагментов цистеина

Рис. 3. Защитные механизмы для реактивации окисленных транскрипционных факторов

Молекула Trx играет роль глутатиона и может уменшить окисленные тиоловые группы. Окисленный Trx регенирируется Trx-редуктазой. При окислительном стрессе Trx переносится в ядро, где может непосредственно взаимодействовать с транскрипционным фатором (TF) или участвовать в окислительно-восстановительном каскаде содержащим Ref. Этот механизм позволяет максимально эффективно опосредовать генную транскрипцию несколькими транскрипционными факторами [40].

ГЛАВА 2. ОХРАНА ТРУДА

Охрана труда - это система правовых, социально-экономических, организационно-технических, санитарно-гигиенических и лечебно-профилактических мероприятий и средств, направленных на сохранение здоровья и работоспособности человека в процессе труда.

Статья 43 Конституции Украины, закрепляя право граждан на труд, одновременно устанавливает, что данное право должно осуществляться в условиях, отвечающих требованиям безопасности и гигиены. В 1992 г. в Украине был принят Закон «Об охране труда», определивший основные положения по реализации конституционного права граждан на охрану их жизни и здоровья в процессе трудовой деятельности.

Согласно статье 159 («Обязанность работника выполнять требования нормативных актов об охране труда») работник обязан: знать и выполнять требования нормативных актов об охране труда, правила обращения с машинами, механизмами, оборудованием и другими средствами производства, пользоваться средствами коллективной и индивидуальной защиты; соблюдать обязательства по охране труда, предусмотренные договором и правилами внутреннего трудового распорядка предприятия, учреждения, организации; проходить в установленном порядке предварительные и периодические медицинские осмотры; сотрудничать с собственником или уполномоченным им органом в деле организации безопасных и безвредных условий труда, лично принимать посильные меры по устранению любой производственной ситуации, создающей угрозу его жизни или здоровью или людей, которые его окружают, и окружающей природной среде, сообщать об опасности своему непосредственному руководителю или другому должностному лицу [2].

В лабораториях биологического профиля действует следующая инструкция по охране труда, обязательная для всех работающих в лаборатории. К работе в лабораториях биологического профиля допускаются лица не моложе 18 лет, прошедшие медицинское освидетельствование, после изучения настоящей инструкции. Сотрудники, работающие в лабораториях биологического профиля, должны проходить инструктаж по охране труда не реже одного раза в 6 месяцев, а также аттестацию по охране труда и электробезопасности. Студенты проходят инструктаж перед началом выполнения практикума в каждом семестре. Студенты и сотрудники обязаны выполнять требования ОТ и соблюдать правила внутреннего распорядка. В каждой лаборатории на видном месте должна находиться аптечка, которая содержит необходимые медикаменты для оказания первой медпомощи (бинты стерильные, растворы йода, 2 % раствор двууглекислой соды, 5 % раствор лимонной кислоты, перманганат калия, нашатырный спирт). Рабочее место в лаборатории должно содержаться в чистоте. На рабочем месте должны находиться только необходимые для конкретной работы реактивы, приборы и оборудование. Запрещается загромождать проходы и доступы к электрощитам, вытяжным шкафам, лабораторным столам, выходам. Все используемые в лаборатории электроприборы должны быть заземлены. Присоединение проводников должно быть выполнено сваркой или надежным болтовым соединением. Студенты приступают к выполнению работы только после осмотра рабочего места руководителем (преподавателем, лаборантом) и получения разрешения на ее проведение. Запрещается пребывание студентов в лаборатории без присутствия преподавателя (лаборанта). Во время выполнения работы запрещается оставлять без присмотра даже на непродолжительное время работающие установки, включенные электроприборы, газовые горелки и др. Все работы в лаборатории производить только в спецодежде (халате), при мытье посуды необходимо надевать резиновые перчатки, особенно при спользовании хромовой смеси или концентрированных щелочей. При работе в лабораториях кафедры могут использоваться жидкости и вещества, пары которых способны вызвать отравление (формалин, эфир, хлороформ, кислоты и т.д.), поэтому следует строго выполнять требования техники безопасности при работе с химическими веществами I - IV класса опасности. Все работы с вредными веществами производить под тягой при спущенных рамах. Запрещается нюхать и пробовать на вкус неизвестные вещества и растворы, набирать ртом жидкости в пипетку. Все хранящиеся в лабораториях реактивы должны быть внесены в опись с указанием названия, количества, степени очистки, снабжены этикетками с четким указанием названия вещества, для раствора - его концентрации. Запрещается пользоваться реактивами без этикеток или с неясными подписями на них. Необходимо внимательно следить за сохранением чистоты реактива, ни в коем случае нельзя путать пробки от банок с реактивами, доставать вещество из банки грязным шпателем. Запрещается сливать в раковины отходы химреактивов и органических растворителей, отходы тяжелых металлов и их соединений и также других токсических веществ, их следует собирать в специальные емкости, снабженные соответствующими надписями. По окончании работы необходимо отключить аппаратуру, газ, воду, освещение, вентиляцию, электроустановки, проверить герметичность сосудов с летучими веществами, опустить дверцы вытяжных шкафов, убрать рабочее место. При возникновении аварийных ситуаций следует немедленно прекратить работу и поставить в известность администрацию (зав. кафедрой, декана и др.). В случае коротких замыканий электрооборудования необходимо немедленно отключить питающее напряжение на главном электрощите. При наличии запаха газа следует открыть форточки, в помещении не зажигать огня, не включать освещение внутри помещения, выключить все нагревательные приборы и обесточить электрооборудование общим рубильником вне помещения. До полного проветривания помещения, устранения места утечки газа к работе не приступать. Разлитые кислоты и щелочи, горючие жидкости необходимо немедленно засыпать песком, песок убрать совком [10]. Облитая щелочью или кислотой одежда первоначально обмывается водой и немедленно нейтрализуется: в случае кислоты - 2 % раствором аммиака, а в случае щелочи - 5 % раствором уксусной, винной или щавелевой кислоты. В случае возникновения пожара необходимо данный участок обесточить общим рубильником на силовом щите, немедленно сообщить о пожаре и месте его возникновения дежурному пожарной охраны и принять меры к его тушению имеющимися противопожарными средствами (огнетушитель, песок, кошма и др.). В случае получения травмы необходимо освободить пострадавшего от действия травмирующего фактора, обстановку на месте аварии сохранить такой, какой она была в момент происшествия, если это не угрожает опасностью другим, оказать пострадавшему первую доврачебную медицинскую помощь, вызвать пострадавшему врача [20].

При работах с использованием лабораторных центрифуг необходимо проверить состояние центрифуги, смазку, надежность крепления деталей. Перед загрузкой центрифуги проверить, нет ли в барабане и на кожухе центрифуги посторонних предметов. Затем закрыть крышку кожуха центрифуги и проверить исправность ее блокировки. Следует непрерывно наблюдать за работой центрифуги. Если возникают, какие-либо неисправности, необычный шум или стук, немедленно сообщить об этом руководителю работ. Перегрузка барабанов центрифуги не допускается. К тому же, во избежание биения барабана в центрифугах не допускается односторонней перегрузки барабана. Во избежание травм разгружать центрифугу следует только после полной остановки барабана [9].

При работе с лабораторными животными опасными факторами являются:

дезинфицирующие средства (дихлофос, карбофос и др.);

инфицирование естественными инфекционными болезнями экспериментальных животных, возбудители которых являются патогенными для человека;

инфицирование инфекционными болезнями животных, зараженных возбудителями опасными для людей;

укусы животных.

Во время работы с животными при выполнении всех операции необходимо быть спокойными, уверенными, но не грубыми. Не допускать резких окриков. Животные должны содержаться в клетках с надежно запирающимися дверками. Для переноски животных используют переносные ящики или клетки. После использования ящик или клетку дезинфицируют. При обслуживании животных необходимо пользоваться кожаными или стеганными рукавицами. При ловле животных применяются сачки, ловушки, рогатки, а для фиксации пасти - специальные зажимы или тесемки. При укусах животными необходимо промыть рану раствором перекиси водорода, обработать йодом и наложить стерильную повязку [14].

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Объект исследования

В работе использовались 3х-месячные крысы-самцы линии Wistar массой 140-225г, содержавшиеся в стандартних условиях вивария Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина.

Животные были разделены на 2 группы с помощью теста «Открытого поля» до эксперимента по количеству физиологических отправлений. Открытое поле - это хорошо освещенная квадратная арена 1Ч1 м, стенкой 50 см, пол которой размечен линиями на квадраты.

Крысу выпускали в центральный квадрат, и в течение 5 мин регистрировали поведенческие реакции, в том числе и уровень дефекации и уринации. Тест заключается в количественном измерении компонентов поведения животного, помещенного в новое открытое пространство, выбраться из которого ему мешает огораживающая арену стенка. Страх, который испытывают животные при помещении их в новую потенциально опасную среду, сопровождается высоким уровнем дефекации и уринации. [13]

Таблица 1. Эмоциональный статус и масса крыс, составляющих экспериментальные группы.