2.1 Анализ лекарственных растений, содержащих флавоноиды

Флавоноиды - это растительные ароматические соединения, производные дифенилпропана (С₆-С₃ - С₆) различной степени окисленности и замещения. Флавоноиды можно рассматривать как производные хромана и хромона, содержащие в положении 2, 3 или 4 арильный радикал.

Классификация флавоноидов основана на ряде признаков, таких как степень окисленности пропанового фрагмента, положение бокового фенильного радикала, величина гетероцикла и др. По расположению кольца В выделяют собственно флавоноиды (эуфлавоноиды), изо- и неофлавоноиды.

В растениях флавоноиды встречаются преимущественно в виде гликозидов реже - в виде агликонов. Многообразие флавоноидных гликозидов обусловлено значительным набором сахаров и местом присоединения их к агликону, а также тем, что сахара могут иметь различную величину и конфигурацию циклов и гликозидных связей (фуранозная и пиранозная формы моносахаридов, D - и Z-изомеры, а - или Р-связь), порядок и сочетание сахаров и связей.

По типу связи различают О - и С-гликозиды флавоноидов. О-гликозиды легко гидролизуются кислотами и ферментами. С-гликозиды не гидролизуются ферментами и разбавленными кислотами, их гидролиз осуществляется смесью Килиани (хлористоводородная концентрированная и уксусная кислоты).

Физико-химические свойства. Флавоноиды (от лат. flavus - желтый) - кристаллические оптически активные вещества, имеющие окраску от белой до желто-оранжевой в зависимости от структуры. Например, флаваноны, изофлавоны - бесцветные, флавоны и флавонолы - желтые, халконы и ауроны имеют цвет от ярко-желтого до красно-оранжевого. Антоцианы окрашены в красный или синий цвет в зависимости от рН среды. Флавоноиды лишены запаха, некоторые из них имеют горький вкус. Самым горьким является нарингенин, который в 5 раз более горький, чем хинина гидрохлорид.

Агликоны хорошо растворяются в диэтиловом эфире, ацетоне и спиртах, почти не растворяются в бензоле и хлороформе. Флавоноидные гликозилы растворяются в спиртах и спирто-водных смесях. Монозиды лучше растворимы в крепком спирте, дигликозиды - в 50 % -ном спирте, гликозиды с тремя и более сахарами - в слабом спирте и даже в воде.

Выделение. Для выделения флавоноидов используют последовательную экстракцию сырья рядом органических растворителей с возрастающей полярностью: хлороформ, ацетон, спирт и спирто-водные смеси.

Для качественных реакций используют извлечение, очищенное от сопутствующих липофильных веществ.

Качественные реакции. Общей реакции, специфической для всех классов флавоноидов, не существует. Наиболее часто для обнаружения флавоноидов в ЛPC применяют цианидиновую реакцию (проба Snoda). Реакция основана на восстановлении флавоноидов атомарным водородом в кислой среде до антоцианидинов с образованием ярко-розового окрашивания.

Цианидиновую реакцию не дают халконы, ауроны, катехины, но они могут образовывать в кислой среде окрашенные оксониевые соли.

Цианидиновая реакция по Брианту позволяет определить агликоновую или гликозидную природу исследуемого вещества. К окрашенному раствору продукта цианидиновой реакции прибавляют равный объем н-октанола и встряхивают. Гликозиды остаются в воде, а агликоны переходят в слой органического растворителя.

С раствором щелочи флавоны, флавонолы, флаваноны приобретают желтое окрашивание, халконы и ауроны - желто-оранжевое, оранжево-красное.

С железа (III) хлоридом образуются окраски от зеленой (флавонолы) до коричневой (флаваноны, халконы, ауроны) и красновато-бурой (флавоны).

Флавоны, халконы, ауроны, содержащие свободные ортогидроксильные группы в кольце В, при обработке спиртовых растворов свинца ацетатом средним образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый или красный цвета. Антоцианы образуют осадки, окрашенные как в красный, так и в синий цвет.

Флавоноиды вступают в реакцию комплексообразования с 5 % -ным спиртовым раствором алюминия хлорида, с 2 % -ным спиртовым раствором циркония (III) хлорида. Флавоноиды, имеющие две оксигруппы у С-3 и С-5, дают хелаты желтого цвета за счет образования водородных связей между карбонильной и гидроксильными группами.

Реакция с борно-лимонным реактивом (реакция Вильсона). Флавоноиды, у которых гидроксильная и карбоксильная группы отделены углеродным атомом, образуют комплексы с кислотой борной, которые не разрушаются лимонной и щавелевой кислотами.

При этом появляется желтая окраска или ярко-желтая флуоресценция, которая резко усиливается в УФ-свете.

Флаваноны и флаванонолы восстанавливаются натрия боргидридом с образованием окрашенных продуктов пурпурно-красного, фиолетового или синего цвета.

Катехины, а также производные флороглюцина и резорцина с 1 % -ным раствором ванилина в кислоте хлористоводородной концентрированной образуют малиново-красное окрашивание.

Хроматографический анализ. Для идентификации флавоноидов широко применяют различные виды хроматографии: бумажную, ТСХ, газожидкостную. Учитывают окраску пятен в видимом и УФ-свете до и после проявления хромогенными реактивами, величину Rf, или время удерживания.

Флавоны и флавонол-3-гликозиды в УФ-свете обнаруживаются в виде коричневых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды - в виде желтых или желто-зеленых пятен. Изофлавоноиды в видимом свете не проявляются.

После просматривания в УФ-свете хроматограммы обрабатывают одним из реактивов: 5 % -ным спиртовым раствором AlCl₃ с последующим нагреванием при 100±5°С в течение 3-5 мин; 5 % -ным раствором SbCl₃ в тетрахлорметане; 10 % -ным спиртовым раствором щелочи. Это позволяет получить зоны с более яркой флюоресценцией в УФ-свете (таб 2.1).

Таблица 2.1

Окраска пятен флаваноидов на хроматограммах.

Количественное определение. Универсального метода количественного определения флавоноидов нет. В каждом отдельном случае подходят индивидуально, используя весовой, фотометрический, полярографический, потенциометрический, объемный или комплексонометрический методы.

Наибольшее распространение получили спектральные методы анализа, которые можно классифицировать по реакциям образования окрашенных продуктов: восстановления в кислой среде или с натрия боргидридом; реакции комплексообразования с металлами; соединение с солями диазония; взаимодействие со щелочами.

Биологическая активность. Флавоноиды обладают широким спектром дей-ствия: капилляроукрепляющим, желчегонным, диуретическим, гепато-защитным, седативным, противовоспалительным, противоязвенным, гемо - статическим, бактерицидным, гипотензивным, гипогликемическим, анабо-лизирующим, противолучевым, антиоксидантным и др.