Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири

дипломная работа

Список сокращений

ТБ - туберкулез

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

МБТ - микобактерии туберкулеза

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

РХФ - равновесие Харди-Вайнберга

NRAMP1 - макрофагальный белок, ассоциированный с естественной ресистентностью

NRAMP1 - ген макрофагального белка, ассоциированного с естественной резистентностью

MBP - маннозо - связывающий белок

TNFб - фактор некроза опухолей б

TNFА - ген фактора некроза опухолей б

VDR - ген рецептора к витамину D

HLA - главный комплекс гистосовместимости человека

INF-г - гамма интерферрон

IL-1в - интерлейкин-1в

IL-12в - интерлейкин-12в

IL1B - ген интерлейкина-1в

IL12B - ген интерлейкина-12в

IL1RN - ген антагониста рецептора к интерлейкину-1в

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) от туберкулеза (ТБ) ежегодно умирают более двух миллионов человек во всем мире. В связи с этим в 1993 г. ТБ объявлен всемирной опасностью. Несмотря на наметившиеся тенденции к стабилизации и позитивную динамику отдельных показателей, эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации остается сложной [Перельман М.И., 2001; Онищенко Г.Г., 2003; Ерохин В.В., 2003; Белиловский и др., 2003]. В 27 субъектах РФ уровень заболеваемости значительно выше, чем по стране, причем наибольшие показатели отмечены в Сибирском федеральном округе [Мурашкина Г.С. и др., 1999; Краснов В.А., 2004]. Таким образом, ТБ является одной из самых серьезных медико-социальных проблем здравоохранения, как Томской области, так и в целом России [Перельман М.И., 2003; Стрелис А.К., 2004].

Несомненно, ключевым звеном патогенеза заболевания является проникновение микобактерий туберкулеза (МБТ) в организм человека. Однако нельзя недооценивать роль предрасполагающих факторов, к которым относят возраст больного, сопутствующие заболевания, неблагоприятное влияние факторов внешней среды, различные патологические состояния специфического и неспецифического иммунитета [Давыдовский И.В., 1962].

Известно, что туберкулезной инфекции свойственен выраженный клинический полиморфизм [Пузик В.И. и др., 1973]. Основой для такой вариабельности клинического течения болезни является не только внешние средовые причины, но и генетически детерминированные [Апт А.С и др., 1982; Хоменко А.Г., 1990]. Благодаря врожденной относительной резистентности человека к туберкулезу заболевает лишь малая часть инфицированных МБТ, в то время как, по данным ВОЗ, инфицируется практически каждый третий житель планеты.

Близнецовые и генетико-эпидемиологические исследования установили важную роль наследственности в развитии туберкулеза [Чуканова В.П. и др., 2001; Kallman F., Reisner D., 1943; Comstock G.W., 1978; Fine P.E.M., 1981].

С генетической точки зрения ТБ, как и большинство инфекционных заболеваний, относят к мультифакториальной патологии, которая представляет собой результат сложного взаимодействия большого числа генов с разнообразными факторами окружающей среды [Мороз А.М., Торонджадзе В. Г., 1977; Березовский Б.А. и др., 1986]. Современные достижения в области молекулярной генетики открыли новые перспективы в изучении патогенеза болезней: появилась возможность идентифицировать гены, продукты экспрессии которых принимают участие в развитии патологических состояний [Hill A. V. S., 1999].

Важнейший этап патогенеза туберкулеза - персистенция возбудителя в фагосомах макрофагов [Авербах М.М. и др., 1982; Литвинов В.И. и др., 1983]. Макрофаги поглощают патоген в очагах воспаления, но часто теряют способность элиминировать его в лизосомах, что в итоге приводит к их массированному размножению и последующему выходу из погибших клеток [Myrvik Q. et al., 1984]. В связи с этим в число генов-кандидатов туберкулеза входят гены, продукты которых участвуют в процессе фагоцитоза микобактерий. Современные характеристики туберкулезной инфекции диктуют необходимость контроля прохождения микобактерии по эндосомально - лизосомальному пути.

Одним из методов анализа роли генетических факторов в возникновении и развитии распространенных заболеваний является исследование ассоциаций генетических маркеров с заболеваниями [Пузырев В.П., 2000; Collins F.S., 1999; McKusick V., 2000]. В основе такой ассоциации маркера с болезнью могут лежать три причины. Во-первых, наличие ассоциации может свидетельствовать о том, что ассоциированный локус и есть ген или один из генов болезни. Во-вторых, причиной ассоциации может быть неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом болезни. И, наконец, ассоциация может быть артефактом, возникшим вследствие подразделенности популяции [Пузырев В.П., Степанов В.А., 1997]. Феномен ассоциации генетического маркера с заболеванием или каким-либо признаком болезни определяется дифференциальной приспособленностью носителей разных генотипов [Алтухов Ю.П., 2003].

Одним из приоритетных направлений в активном выявлении туберкулеза является определение групп риска. Формирование этих групп требует методологически правильного подхода, основанного на четком знании факторов, определяющих повышенный риск заболевания [Горбач Н.А. и др., 2004]. Методами молекулярной медицины было установлено, что у человека гены многих ферментов, рецепторов и других белков характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые не приводят к значимым изменениям первичной структуры белка, и соответственно, очевидным патологическим последствиям, но оказывают влияние на функциональную активность кодируемых белков. Эти специфические для конкретной патологии маркеры могут быть выявлены задолго до ее клинической манифестации, что позволит определить группы риска, организовать их мониторинг, а в случае необходимости, предложить индивидуально обоснованную профилактику и превентивную терапию. Таким образом, идентификация генов и их аллелей, участвующих в определении чувствительности или резистентности к туберкулезу, позволит не только глубже проникнуть в фундаментальные механизмы иммунитета и патологии этой инфекции, но и будет способствовать усовершенствованию лечебно-профилактических мероприятий.

Настоящее исследование является фрагментом изучения подверженности к туберкулезу в различных этнических группах, которое проводится в ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН под руководством академика РАМН В.П. Пузырева. Получены результаты исследования роли генов-кандидатов в возникновении и развитии туберкулеза у тувинцев [Рудко А.А., 2004]. Нами изучено влияние генов NRAMP1 (ген макрофагального белка, ассоциированного с естественной резистентностью), VDR (ген рецептора к витамину D), IL12B (ген интерлейкина 12В), IL1B (ген интерлейкина 1В), IL1RN (ген антагониста рецептора к интерлейкину 1В) на предрасположенность к туберкулезу у русских г. Томска. Выбор сходных полиморфизмов генов для оценки резистентности к ТБ у тувинцев и русских позволил провести сравнительный анализ распространенности исследованных маркеров у больных и здоровых представителей данных этнических групп населения.

Цель исследования: изучить роль полиморфных вариантов генов NRAMP1, VDR, IL12B, IL1B и IL1RN в возникновении и развитии туберкулеза у русских жителей г. Томска.

Задачи исследования:

Изучить распространенность и межлокусное взаимодействие полиморфных вариантов гена NRAMP1 (469+14G/C, D543N, C274T, 1465-85G/A), аллельных вариантов генов VDR (B/b, F/f), IL12В (A1188C), IL1B (+3953A1/A2), IL1RN (VNTR) у русских г. Томска.

Оценить частоту встречаемости больных туберкулезом среди родственников больных и здоровых лиц.

Провести анализ ассоциаций полиморфизма исследуемых генов с туберкулезом.

Исследовать влияние изучаемых аллельных вариантов на варьирование патогенетически значимых признаков болезни.

Провести сравнительный анализ русских г. Томска и жителей Тувы по распространенности исследованных генов, гаметическому неравновесию между парами полиморфизмов генов и выявленным ассоциациям.

Научная новизна:

Впервые получены сведения о распространенности аллельных вариантов генов NRAMP1, VDR, IL12B, IL1B, IL1RN у русских жителей г. Томска. Проведен межпопуляционный сравнительный анализ генов-кандидатов туберкулеза у русских и тувинцев, установивший отличия в распределении генотипов и частот аллелей по всем исследованным генетическим маркерам. Показано, что структура неравновесия по сцеплению между полиморфизмами гена NRAMP1 идентична у русских и тувинцев. Изучено влияние полиморфизма генов-кандидатов туберкулеза на возникновение и развитие различных клинических вариантов заболевания. Впервые выявлены ассоциации полиморфизма +3953А1/А2 гена IL1B c ограниченным деструктивным ТБ легких, VNTR полиморфизма гена IL1RN и полиморфизма 274С/Т гена NRAMP1 с распространенной деструктивной формой заболевания, полиморфизма 1465-85G/A гена NRAMP1 с первичным туберкулезом и полиморфизма 1188А/С гена IL12B как с распространенным деструктивным туберкулезом легких, так и с первичной по генезу формой патологии. Показана связь полиморфизма генов IL12B, NRAMP1 и VDR с патогенетически важными для ТБ качественными и количественными характеристиками патологического процесса: объемом поражения ткани легкого, деструктивными изменениями, уровнем палочкоядерных нейтрофилов, а также СОЭ у женщин.

Практическая значимость:

Полученные результаты исследования полиморфизма генов-кандидатов туберкулеза представляются важными для формирования представлений о взаимосвязи особенностей генофондных параметров популяции с закономерностями распространения этого инфекционного заболевания, позволяют глубже проникнуть в фундаментальные механизмы иммунитета и патологии ТБ. Сведения о вкладе полиморфизма исследованных генетических маркеров в формирование вариабельности подверженности к этому заболеванию, а также в определение различий клинических проявлений болезни, могут быть использованы при организации профилактических и лечебных мероприятий. Полученные данные могут быть полезны в уточнении стратегии формирования групп риска по заболеванию туберкулезом.

1. Обзор литературы

1.1 Роль наследственных факторов в возникновении и развитии туберкулеза

Туберкулез известен с глубокой древности. Об этом свидетельствуют многочисленные литературные данные и исторические факты. Научные материалы палеонтологов указывают на древний возраст микобактериальной инфекции. На костях древнеегипетских мумий эпохи бронзы удалось обнаружить несколько бесспорных туберкулезных поражений. Большая заслуга в этом принадлежит английскому исследователю Арманду Рафферу (1921) [Холмовская М.Б., 1997].

Некоторые признаки легочной чахотки описаны в египетских папирусах, а так же в произведениях древнейших китайских ученых и в священных книгах индусов [Хоменко А.Г., 1990]. Уже в те времена исследователи пытались объяснить вопрос, который интересовал многих. Почему некоторые люди более подвержены туберкулезу, чем другие?

Решалась эта проблема различными учеными по-разному, в зависимости от уровня знаний в тот или иной период человеческой истории. Гиппократ, а так же его современники считали туберкулез наследственной болезнью: "Некоторые - более устойчивы в болезнях, другие совершенно не способны им противостоять. Как от родителей эпилептиков рождаются дети-эпилептики, так от чахоточных рождаются дети предрасположенные к чахотке" [Цит. по Рабухин А.Е., 1959].

Однако уже в те времена высказывалась мысль о заразности легочной чахотки. Так в Персии, по свидетельству Геродонта, обычно изолировали не только "прокаженных, но и чахоточных и золотушных" больных, запрещали им оставаться в городах и поддерживать какую-либо связь с окружающим населением [Рабухин А.Е., 1948].

С открытием возбудителя туберкулеза роль наследственности при этом заболевании фактически перестала признаваться. В течение длительного времени во фтизиатрии основное внимание уделялось изучению возбудителя болезни, патологических изменений и их клинических проявлений.

В настоящее время общепризнанно, что этиологическим фактором туберкулеза являются микобактерии туберкулеза (МБТ). Туберкулез - инфекционное заболевание, которое отличается преимущественно хроническим течением различных клинических форм, своеобразием специфических иммунологических и морфологических проявлений. Однако проникновение в организм возбудителя туберкулеза является необходимым, но недостаточным условием для развития болезни. В патогенезе туберкулеза немаловажную роль играют так называемые способствующие факторы. К таким факторам относят некоторые свойства макроорганизма (пол, возраст, сопутствующие заболевания, общая реактивность организма и т.д.), вирулентность микобактерии туберкулеза и массивность инфицирования, а также воздействие внешней среды (неблагоприятная микросоциальная среда, социально-гигиенические факторы и низкий экономический уровень жизни), при котором происходит инфицирование. Иногда роль сопутствующих факторов в этиологии туберкулеза выступает на первое место [Давыдовский И.В., 1962].

Несомненно, что семейное накопление туберкулеза обусловлено общностью внешнесредовых факторов, воздействующих на каждого члена семьи. Но даже в условиях тесного семейного контакта с бактериовыделителем не все члены семьи заболевают туберкулезом. Если проследить историю взаимодействия человеческой популяции с возбудителями инфекционных болезней, то можно заметить, что эпидемии особо опасных заболеваний не заканчивались полным вымиранием. Выживали индивиды - возможно, носители определенных генетических систем, имеющих отношение к сопротивляемости соответствующим инфекциям [Хоменко А.Г., 1990].

Туберкулез отличается клиническим полиморфизмом, что проявляется различными формами заболевания - от малых с бессимптомным течением до обширных деструктивных процессов в легких с выраженной клинической картиной, а также наличием туберкулезного процесса различной локализации в других органах [Пузик В.И. и др., 1973]. По-видимому, причины такого разнообразия проявлений туберкулеза могут определяться не только неблагоприятным сочетанием внешних факторов, но и внутренними, наследственными причинами.

Степень влияния наследственных факторов на возникновение и течение болезни при разной патологии неодинакова. В одних случаях генетически могут быть детерминированы несовместимые с жизнью дефекты, в других - речь может идти об одном из многих компонентов патогенеза заболевания.

Чувствительность к туберкулезу у разных видов животных существенно варьирует: от врожденной резистентности крыс, до крайней подверженности у морских свинок. Кроме того, существуют внутривидовые отличия в подверженности к данному заболеванию [Гамалея Н.Ф., 1939; Авербах М.М. и др., 1980; Сабадаш Е.В. и др., 2002].

Аналогичным образом человеческая популяция проявляет врожденную относительную резистентность к туберкулезу [Апт А.С. и др., 1982; Авербах М.М. и др., 1982; Мороз А.М., 1984]. Благодаря этому заболевает лишь малая часть инфицированных МБТ, в то время как по данным ВОЗ инфицируется практически каждый третий житель планеты. Подобная избирательность свидетельствует о том, что не все члены популяции в равной степени подвержены туберкулезу.

Исследуя группу больных туберкулезом методом изучения их родословных, В. Г. Штефко (1930) провел параллели между конституциональными признаками и заболеванием. Так же он установил различное течение болезни у лиц разной национальности. Полученные данные позволили предположить существование наследственной предрасположенности к туберкулезу.

Выявление при профилактических флюрографических обследованиях рентгенположительных лиц с зажившими элементами перенесенной первичной инфекции, у которых наступило спонтанное излечение, также свидетельствует о том, что не все люди в равной степени подвержены заболеванию туберкулезом в условиях заражения микобактериями туберкулеза.

Б. А. Березовский и соавт. (1986) провели анализ частоты болезни среди родственников больных туберкулезом, не находившихся в контакте с последними, а также в контрольной группе здоровых лиц. Полученные результаты выявили достоверные различия в сравниваемых группах, при этом частота туберкулеза среди родителей и сибсов пробанда более чем в 5 раз превышала таковую в популяции. На основании этих данных было сделано предположение, что наряду с известными, достаточно изученными причинами возникновения туберкулеза легких определенное значение в его развитии имеют генетические факторы.

Анализ 33 больных рецидивирующим туберкулезом с бактериовыделением после завершенной химиотерапии показал, что из 25 лиц находившихся с этими больными в контакте, 5 остались неинфицированными. В тоже время среди остальных туберкулинположительных лиц из контакта не отмечено случаев заболевания туберкулезом [Golli V. et al., 1981].

Сходные результаты получили и другие авторы, наблюдавшие за лицами из семейного контакта с 458 больными туберкулезом в течение 4 лет после выявления источника инфекции. Всего за 4 года было выявлено, что среди 1250 лиц из семейного контакта заболели лишь 48 из них преимущественно на 1-ом и 2-ом году наблюдения [Kameda K. et al., 1983].

H. Hara и соавторы (1982) приводят данные о том, что из 28 человек, находящихся в контакте с бациллярными больными, лишь у 6 на протяжении 2,5 лет был установлен туберкулез.

Под руководством академика РАМН А. Г. Хоменко было осуществлено комплексное генетико-эпидемиологическое исследование, в котором принимали участие 522 многодетные семьи узбекской, туркменской, молдавской этнических групп. Задача данного исследования сводилась к определению коэффициента наследуемости (подверженности, предрасположенности). Для этого обследовали более 5000 родственников первой и второй степени родства по отношению к пробандам, которые страдали туберкулезом легких.

Результаты исследования установили семейное накопление туберкулеза среди различных групп родственников разной степени родства. При этом в семьях пробандов, которые болели деструктивным туберкулезом легких и являлись бактериовыделителями, частота туберкулеза среди родственников первой степени родства значительно превышала частоту заболевания среди населения не только при наличии семейного контакта (в 7,2 раза), но и при отсутствии тесного семейного контакта (в 5 раз). Кроме того, аналогичным образом во всех обследованных этнических группах в семьях родственников первой степени родства, где пробанды болели недеструктивными формами туберкулеза без бактериовыделения, частота туберкулеза легких в 4,3 раза превышала частоту заболевания среди населения сопоставимого возраста [Чуканова В. П. и др., 2001].

У родственников второй степени родства (племянников пробандов), которые не состояли в семейном контакте с пробандами, установлено, что частота туберкулеза среди них превышала частоту заболевания среди населения соответствующего возраста в 2-2,5 раза. Учитывая более отдаленную степень родства, увеличение частоты заболевания в этой группе родственников в большей мере подчеркивает значение генетических факторов в семейном накоплении заболевания. Выявленные закономерности распространения туберкулеза позволяют считать, что среди кровных родственников больных туберкулезом легких риск развития болезни значительно выше, чем среди всего населения.

Особый способ клинико-генеалогического изучения предрасположен-ности к болезням - изучение заболеваемости индивидов, генетически не родственных с больным туберкулезом (супруги пробандов, приемные дети), но связанных с ним общностью семейных средовых влияний. Анализ распространенности туберкулеза среди супругов пробандов, не состоящих в кровном родстве с больными туберкулезом, но находившихся с ними в семейном контакте, установил, что частота туберкулеза легких в этой группе достоверно не отличалась от частоты заболевания среди населения обследованных этнических групп [Чуканова В. П. и др., 1995].

На основании проведенных популяционных исследований были выявлены этнические особенности в патогенезе и клиническом течении туберкулеза [Хаудамова Г.Т., 1991; Хоменко А.Г., 1996; Stead W.W., 1992; Bellamy R., 1998]. Анализ заболеваемости туберкулезом органов дыхания основных этнических групп Казахстана (казахов и русских) выявил повышенный риск (в 3 раза) заболевания коренного населения [Хауадамова Г.Т., 1991].

Вероятно, большая часть такой этнически зависимой предрасположенности обусловлена факторами внешней среды, то есть определенными традициями данной популяции, экономическими причинами и т. д. Однако имеются данные о том, что более подвержены туберкулезу популяции, происходящие с территорий свободных от этого заболевания [Bellamy R., 1998; Stead W.W., 1992]. Данное положение легко объяснимо с точки зрения естественного отбора. Резистентность к туберкулезной инфекции создавалась и поддерживалась в процессе симбионтных отношений макро- и микроорганизмов [Земскова З.С., Дорожкова И.Р., 1984].

С целью разделения генетических и средовых эффектов и оценки их соотносительного вклада в этиологию и патогенез туберкулеза были предприняты близнецовые исследования [Kallman F., Reisner D., 1943; Comstock G.W., 1978; Fine P.E.M., 1981]. Эти работы показали, что заболеваемость туберкулезом монозиготных близнецов в среднем в 3,5 раза выше, чем дизиготных.

Полученные в ходе близнецовых исследований факты свидетельствовали о генетической подоплеке туберкулеза, однако, не предоставили данных о типе наследования заболевания. Генетический анализ восприимчивости и резистентности к туберкулезу, проведенный на лабораторных животных, показал, что наследование этих признаков носит сложный, полигенный характер [Lurie M.B. et al., 1952; Lynch C.J. et al., 1965].

На основании экспериментальных исследований была выдвинута гипотеза мультифакториального типа наследования предрасположенности к туберкулезу легких [Мороз А. М., Торонджадзе В. Г., 1977]. Позднее Б. А. Березовский и соавт. (1986) сравнили имеющиеся сведения по генетике туберкулеза с критериями мультифакториального наследования, предложенными J.H. Edwards (1969). Полученные в ходе сравнения результаты подтвердили высказанную ранее гипотезу.

С генетической точки зрения, мультифакториальные заболевания представляют результат сложного взаимодействия большого числа генов с разнообразными факторами окружающей среды. В отличие от менделирующей патологии, в основе которой лежат редко встречаемые "главные гены", но со значительными эффектами, при мультифакториальных болезнях генетическая система полигенов представлена огромным числом аллельных вариантов генов, эффекты которых в отдельности незначительны. Однако их совокупное действие формирует неблагоприятный "генетический фон", который под влиянием дополнительных факторов реализуется в патологический фенотип [Пузырев В. П., 2003].

Современные представления о генетической составляющей мультифакториальных заболеваний во многом связаны с концепцией подверженности и порогового проявления мультифакториального фенотипа [Falconer D., 1965; Edwards J.H., 1969]. Согласно этой концепции, подверженность к заболеванию наследственно обусловлена, но реализация ее возможна только при взаимодействии с факторами среды. Патологический фенотип проявляется при пересечении некоего "порога" подверженности, описываемого количественными признаками. Порог подразумевает наличие резкого качественного различия: за этим порогом на шкале подверженности располагаются пораженные индивиды [Фогель Ф., Мотульски А., 1989].

Развитие молекулярно-генетических технологий позволило решить проблему идентификации конкретных генетических систем, ответственных за предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям. Картирование генов осуществляется в рамках двух стратегий: генов-кандидатов и позиционного клонирования [Пузырев В.П., Степанов В.А., 1997].

Ген определяется как кандидатный, если продукт его экспресии вовлечен в развитие болезни. Анализ ассоциации полиморфизма генов-кандидатов с изучаемой болезнью или патологическими признаками позволяет установить их патогенетическую роль и, таким образом, "картировать" ген заболевания. При позиционном клонировании определение генов подверженности проводится путем анализа сцепления заболевания и маркерами с установленным положением на хромосоме. Это дает возможность картировать болезни, для которых не известны не только гены-кандидаты, но даже детали развития болезни.

Идентификация генов и их аллелей, от экспресии которых зависит чувствительность или резистентность к туберкулезу позволила бы глубоко проникнуть в фундаментальные механизмы иммунитета и патологии этой инфекции. В результате появилась бы возможность использовать методы генетического типирования для выявления среди здоровых людей групп с генетически повышенным риском заболевания, требующих первоочередных мер профилактики и, вероятно, особого подхода к вакцинации [Кобринский Б.А., 1987].

Сложность патогенеза, а так же различия в клиническом проявлении туберкулеза предполагают, что число генов-кандидатов заболевания достаточно велико (табл. 1). При этом вклад каждого из них в суммарную подверженность различен [Hill A.V.S., 1998]. Дело еще более осложняется действием факторов внешней среды, значительно модифицирующих положение порога подверженности туберкулезу. Кроме того, большое значение для определения генов сложнонаследуемых заболеваний имеет также выбор популяции для исследования. Индивидуальные сочетания аллелей генов предрасположенности, формирующие риск заболевания, являются уникальными для каждой популяции, что может быть одной из причин невоспроизводимости в разных выборках результатов анализа сцепления болезни с маркером [Terwilliger J.D. et al., 1997].

Таким образом, само по себе картирование генов туберкулеза еще не исчерпывает все проблемы генетики данной патологии. Следующим за картированием шагом, по-видимому, является изучение совместного действия комплекса генов предрасположенности, выявление его основных функциональных звеньев, установление особенностей взаимодействия с факторами негенетической природы - вот задачи, которые необходимо решить для понимания механизмов нормальной и патологической реализации генетической информации.

Таблица 1 Гены-кандидаты подверженности туберкулезу

Ген

Хромосомная локализация

(MIM)

Название белкового продукта

Функция белка

NRAMP1

2q35 (600266)

Макрофагальный протеин 1, ассоциированный с естественной резистентностью

Транспорт двухвалентных ионов металлов, киллинг внутриклеточно расположенных МБТ

VDR

12q12-q14

(601769)

Рецептор к витамину D

Связывание с витамином D, активация клеточного иммунитета

IL1А, IL1В

2q14(147760)

2q14(147720)

Интерлейкин 1

Интерлейкин 1

Активация клеточного иммунного ответа

IL12В

5q31.1-q33.1

(161561)

Интерлейкин 12

Индукция синтеза IFN-

IFNG

12q14

(147570)

Интерферон

Активация Т-лимфоцитов, макрофагов

TNFА

12р13.2

(191190)

Фактор некроза опухолей

Индукция формирования гранулемы

NOS2

17р13.1-q25

(600719)

Индуцибельная синтаза оксида азота

Цитотоксическое действие

MBP

10q11.2-q21

(154545)

Маннозо-связывающий белок

Активация системы комплемента

HLA

6p21.3

(142860)

Главный комплекс гистосовместимости

Регуляция силы иммунного ответа

IL1RN

2q14.2

(147679)

Антагонист рецептора к интерлейкину-1

Угнетение провоспалительного эффекта

IL12R

19p113.1

(601604)

Рецептор к интерлейкину 12

Связывание интерлейкина 12 на поверхности клеток-мишеней

1.2 Молекулярные механизмы патогенеза туберкулеза у человека

Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание, протекающее с внутриклеточным (в макрофагах) паразитированием микобактерий [Myrvik Q. N. et al., 1984]. Несмотря на самую современную химиотерапию, лечение туберкулеза, как правило, бывает длительным и не всегда эффективным. Одной из причин безуспешного лечения данной инфекции по общепринятому мнению является недостаточная эффективность защитных механизмов макроорганизма, в значительной мере генетически обусловленных. Сведения об участии иммунной системы, складывающихся межклеточных взаимодействиях, накопленные за последние десятилетия, изменили (уточнили) представления о патогенезе туберкулеза.

Туберкулез чаще всего развивается в результате заражения МБТ, которые выделяет в окружающую среду больной человек. Респираторный тракт, а так же кишечник являются входными воротами инфекции. Таким образом, основной путь проникновения патогена - аэрогенный, но возможен и алиментарный. Определенную роль при аэрогенном заражении играет система мукоцилиарного клиренса, позволяющая вывести попавшие в бронхи частицы пыли, капельки слизи, слюны, мокроты, содержащие микроорганизмы. Аналогичным образом, при алиментарном пути проникновения микобактерий защитную роль играет переваривающая функция желудочно-кишечного тракта.

После проникновения патогена в легкие важную роль в защите от инфекции играют альвеолярные макрофаги. Эти клетки непосредственно подавляют рост бактерий, фагоцитируя их, а также они участвуют в реакциях клеточного противотуберкулезного иммунитетах [Авербах М.М. и др., 1982; Литвинов В.И. и др., 1983; Myrvik Q. N. et al., 1984].

Процесс фагоцитоза можно разделить на несколько следующих друг за другом этапов. В первую очередь бактерия прикрепляется к фагоциту, затем следует фаза поглощения микроорганизма, и как следствие ингибиция роста или уничтожение инфекта.

Процесс прикрепления микобактерий к фагоцитам осуществляется посредством рецепторов комплемента, маннозных рецепторов и других рецепторов клеточной поверхности макрофага. Взаимодействие между маннозными рецепторами и инфектом происходит при помощи гликопротеина клеточной стенки микобактерий, имеющего маннозный остаток на обращенной во внешнюю среду части молекулы [Schlesinger L. S., 1996].

Мутации генов, белковые продукты которых вовлечены в механизмы иммунологической защиты, определяют степень резистентности к инфекциям. Маннозо-связывающий белок (МВР) является Са-зависимым белком плазмы крови. Выявлено, что у человека этот белок осуществляет функцию активатора системы комплемента, кроме того, он действует непосредственно как опсонин, взаимодействуя с рецепторами макрофагов [Hill A.V.S., 1998].

Исследовали взаимосвязь полиморфизма гена МВР с чувствительностью к легочному туберкулезу в Индии. Анализ показал, что с туберкулезом ассоциированы три точечных замены в исследуемом гене [Selvaraj P. et al., 1999]. Аналогичное исследование, проведенное в Гамбии, выявило связь полиморфных вариантов данного гена с развитием легочной формы туберкулеза [Bellamy R. et al., 2000].

Фагоцитирующая клетка выбрасывает окружающие микроорганизм псевдоподии, которые затем сливаются на периферии, образуя окруженную мембраной вакуоль [Ерохин В.В., 1974; Leake E.S., Myrvik Q.N., 1971]. Микобактерии, находящиеся в фагосоме попадают под воздействие целого ряда неблагоприятных факторов, направленных на их уничтожение. К таким факторам можно отнести слияние фагосомы с лизосомами, содержащими литические ферменты [Jeckett P. S. et al., 1978]. Так же макрофаг способен производить реактивные радикалы кислорода и азота, играющие, вероятно, основную роль в уничтожении инфекта внутри макрофага [Nelson N., 1999]. Установлено, что "нокаутированные" по гену индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2) мыши не способны противостоять туберкулезной инфекции, у них наблюдался усиленный рост M. tuberculosis в легких, селезенке и печени. Макрофаги этих мышей не производили NO и инфекция распространялась [Jackett P. S. et al., 1978; Walker L., Lowrie D. B., 1981].

Если макроорганизм не в состоянии устранить внутриклеточно размножающихся микобактерий, то в результате хронического воспаления в месте освобождения антигенов происходит скопление большого числа макрофагов, которые выделяют фиброгенные факторы и стимулируют образование грануляционной ткани и фиброза. Возникшая гранулома представляет собой попытку организма ограничить распространение персистирующей инфекции. Однако при интенсивном размножении микобактерий в организме человека и малоэффективном фагоцитозе выделяется большое количество токсичных веществ и индуцируется гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), которая способствует выраженному экссудативному компоненту воспаления с развитием казеозного некроза. В процессе разжижения казеозных масс микобактерии получают возможность бурного внеклеточного размножения, что обусловливает прогрессирование туберкулеза [Ройт А., 1991, 2000].

Важную роль в противотуберкулезной защите играет, секретируемый макрофагами и моноцитами цитокин - фактор некроза опухолей (TNF). Он принимает участие в индукции формирования гранулемы, а так же способствует активации Т-клеток, тем самым повышая антибактериальную активность макроорганизма [Kindler V. et al., 1989; Mohan V. P. et al., 2001]. На модели мышей с "нокаутированным" геном, кодирующим рецептор для TNF, продемонстрировано существенное значение фактора некроза опухолей для выживания в условиях туберкулезной инфекции [Flynn J. L. et al., 1995]. В настоящее время известно несколько мутаций гена TNFА, находящегося в локусе главного комплекса гистосовместимости, однако их связь с туберкулезом не выявлена. Так, в небольшом исследовании, проводившемся в Гамбии, не обнаружили ассоциации полиморфизма 308G/A гена TNFА с клинически подтвержденным туберкулезом. Такой же результат был получен при поиске взаимосвязи полиморфизма гена TNFА c туберкулезом в Бразилии [Knight J. C., Kwiatkowski D., 1999].

При поиске конкретных генетических систем, отвечающих за развитие восприимчивости или резистентности к туберкулезу, в первую очередь обращалось внимание на главный комплекс гистосовместимости человека - HLA-систему, в которой расположены гены иммунного ответа. При этом продукты данного комплекса - антигены HLA - выступали в качестве биологических маркеров. Результаты анализа ассоциаций аллелей HLA-комплекса с туберкулезом показали связь DR-локуса с заболеванием, к тому же выявили высокую рассовую и этническую специфичность. В русской популяции заболевание ассоциировалось с В5, В14 и В17 антигенами HLA-комплекса [Хоменко А.Г., 1996]. Вероятно, гены комплекса HLA оказывают влияние на восприимчивость к туберкулезу, регулируя силу иммунного ответа и обуславливая этнические различия в подверженности ТБ.

Также была выявлена ассоциативная взаимосвязь ряда генетических маркеров - фенотипов крови с возникновением туберкулеза и с характером уже возникшего заболевания. Анализировали распределение фенотипических и генных частот 9 генетических локусов белков крови: ингибитора протеаз, трансферрина, фосфоглюкомутазы 1, кислой эритроцитарной фосфотазы 1, гаптоглобина, витамин-Д-транспортирующего белка, глиоксалазы 1, комплемента и эстеразы Д. При этом выявили существование различий между больными туберкулезом легких и практически здоровыми людьми. Эти различия выражаются в накоплении у больных туберкулезом одних фенотипов и в уменьшении частот других фенотипов. Следует отметить, что полученный эффект касался в основном одних и тех же 6 белковых локусов, что подтверждает их реальное значение в дифференциации между больными ТБ и здоровыми людьми [Богадельникова И.В., 1999].

С целью картирования генов предрасположенности к туберкулезу группа исследователей провели широкомасштабное сканирование генома с использованием 299 высокоинформативных ДНК - маркеров у 173 пар сибсов, полностью конкордантных по развитию туберкулеза [Bellamy R. et al., 2000]. При этом выявили 2 локуса предрасположенности - на длинных плечах хромосомы 15 и Х [Cervino A.C.L. et al., 2002].

На основании экспериментальных исследований, проведенных А.М. Морозом и В.Г. Торонджадзе (1977), были выявлены две линии мышей, оппозитные по своей чувствительности к туберкулезной инфекции. У резистентных линий после внутривенного заражения микобактериями туберкулеза наблюдаются длительный латентный период и медленное развитие инфекционного процесса, выражающееся в персистенции микобактерий на фоне незначительных гранулематозно измененных тканей, не приводящих к гибели животных. В то же время заражение мышей чувствительной линии приводит к быстрому размножению микобактерий в тканях, образованию гранулем в легких, селезенке, печени и быстрой гибели животных [Авербах М.М. и др., 1980; Мороз А. М., 1984]. На этих линиях исследователи изучили некоторые механизмы естественной резистентности и приобретенного иммунитета и высказали предположение, что устойчивость к инфекциям во многом зависит от способности макрофагов подавлять рост микобактерий в своей цитоплазме. Проведенные позднее эксперименты на 60 мышах двух линий, одна из которых чувствительна, другая устойчива к туберкулезной инфекции, полностью подтвердили данное предположение [Ельшанская М. П. и др., 1985].

Важнейший этап патогенеза туберкулеза - персистенция возбудителя в фагосомах макрофагов. Макрофаги поглощают патоген в очагах воспаления, но часто теряют способность элиминировать его в лизосомах, что в итоге приводит к их массированному внутриклеточному размножению и последующему выходу из погибших клеток. Получены данные, свидетельствующие о том, что имеются существенные различия в судьбе фагосом, содержащих вирулентные и авирулентные микобактерии, поскольку только первые препятствуют их слиянию с лизосомами [Myrvik Q. et al., 1984; Frenkel G. et al., 1986].

С точки зрения развития новых подходов к лечению туберкулеза очевидна необходимость контроля прохождения микобактерий по эндосомально-лизосомальному пути: от ранней эндосомы - к поздней, от поздней эндосомы - к лизосоме.

1.3 Физиологические функции белковых продуктов генов-кандидатов подверженности туберкулезу, их роль в патогенезе заболевания

Одним из генов предрасполагающих к развитию туберкулеза является NRAMP1 (от англ. Natural-Resistance-Associated Macrophage Protein 1 gene - ген макрофагального протеина 1, ассоциированного с естественной резистентностью). Более того, R. Bellamy и соавт. (1998) отнесли NRAMP1 к основным кандидатным генам туберкулеза у человека. Белковый продукт этого гена имеет вес около 60 кД, он локализован в лизосомальном компартменте покоящегося макрофага, но во время фагоцитоза он работает на мембране фагосомы [Gruenheid S. et al., 1997]. Nramp1 участвует в процессах активации макрофагов, являясь ключевым звеном в механизме транспорта нитритов из внутриклеточных компартментов в более кислую среду фаголизосомы, где он способен вступать в химическую реакцию с образованием NO [Blackwell J. M., Searle S., 1999].

Белок входит в семейство функционально связанных мембранных белков (к этому семейству относят также Nramp2), ответственных за транспорт двухвалентных катионов, таких как Fe2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+ [Jabado N. et al., 2000; Cellier M. et al., 2001].

Известно, что ионы металлов являются жизненно важными элементами, участвующими во многих метаболических реакциях, происходящих в каждой живой клетке. Следовательно, недостаток, избыток или отсутствие данных элементов может привести к развитию какого-либо патологического состояния или даже к гибели клетки. Постоянство ионов металлов в организме обеспечивается регуляцией их потребления, хранения и выведения. Для того чтобы поддерживалась необходимая концентрация ионов, каждая клетка обладает определенной системой, обеспечивающей транспорт веществ через мембрану. Сбой этой системы или ее части может повлечь за собой потерю равновесия между выведением и поступлением веществ, что приведет к изменению внутриклеточной концентрации ионов. Недостаточный транспорт ионов может оказаться причиной нехватки жизненно важных метаболических элементов, а чрезмерное их накопление может вызвать токсическое воздействие этих же веществ, ведущее к гибели клетки. Возможно, что антибактериальная функция Nramp1 заключается в создании неблагоприятной для бактерии окружающей среды внутри фагосомы [Gruenheid S. et al., 2000; Barton C.H. et al, 1999].

Во время фагоцитоза микроба макрофаг продуцирует активные кислородные метаболиты, которые являются токсичными для бактерии. Выживание патогена во время кислородозависимой перестройки метаболизма фагоцита обеспечивается микробными ферментами, большинство из которых содержат ионы металлов в своих активных центрах [Cellier M. et al., 1994].

В свою очередь истощение запаса ионов металлов в фагосоме, вызванное транспортной деятельностью макрофагального белка ассоциированного с естественной резистентностью, приводит к снижению продукции металлосодержещих ферментов поглощенной бактерией.

Следовательно, дефекты продукции или функции Nramp1 могут приводить к нарушению его транспортной функции и, как следствие, к повышению чувствительности к внутриклеточным патогенам, таким как микобактерии (рис. 1) [Barton C.H. et al., 1999].

Рис. 1. Схема антибактериального действия NRAMP1 [по Пальцеву М.А., 2002]

Опыты, проведенные на инбредных мышах, показали, что уровень естественной резистентности к внутривенному заражению низкими дозами M. bovis (BCG) контролируется одним геном, локализованным в проксимальном регионе мышиной хромосомы 1. Этот локус обозначили как Bcg (также он известен как Lsh или Ity). Два различных фенотипа Bcg были ассоциированны с чувствительностью (Bcg-s) и с резистентностью (Bcg-r) на ранней стадии инфекции, вызванной M. bovis, M. avium, M. lepraemurium, Leishmania donovani, Salmonella typhimurium [Bredley D.J., 1977; Forget A. et al., 1981].

Экспериментальные исследования показали, что через 3 недели после заражения 10 КОЕ M. bovis (BCG) из селезенки мышей Bcg-s высевается на 3-4 порядка больше микобактерий, чем из селезенки мышей Bcg-r [Gros P. et al., 1981].Результаты исследований на моделях мышей позволили утверждать, что высокая чувствительность линий мышей Bcg/Lsh/Ity к заражению внутриклеточными патогенами объясняется дефектом локализованного на 1-ой хромосоме гена в локусе Bcg [Blackwell S.M. et al., 1994; Skamene E., 1994].

При помощи позиционного клонирования изолировали кандидатный ген и обозначили его как Nramp1 [Vidal S.M. et al., 1993]. Позже было подтверждено, что Nramp1 и ген, расположенный в локусе Bcg, идентичны [Govoni G. et al., 1996]. У лабораторных мышей ген Nramp1 имеет 2 аллеля Nramp1-s (восприимчивый, рецессивный) и Nramp1-r (резистентный, доминантный) [Malo D. et al., 1993].

Секвенирование матричной РНК Nramp1 от восприимчивых и резистентных линий мышей показало, что подверженность к инфекции связана с заменой глицина на аспарагиновую кислоту в позиции 169 (G169D) внутри 4-ого трансмембранного домена белка [Malo D. et al., 1994]. Элиминация функции Nramp1 у "нокаутированных" мышей (Nramp1-/-) приводит к повышению восприимчивости к группе бактериальных возбудителей, хорошо адаптированных к выживанию в макрофаге [Govoni G., Gros P., 1998].

Однако нельзя не учитывать, что в выше перечисленных экспериментах на мышах использовался штамм M. bovis (BCG), а он является авирулентным для человека. Более того, E. Medina и R. North (1998) показали, что в то время как Nramp1 действительно контролирует резистентность мышей к заражению M. bovis, резистентность к заражению M. tuberculosis, вероятно, не связана с мутациями данного локуса. Мыши с мутантным (чувствительным к заражению M. bovis) фенотипом не отличались по чувствительности к заражению M. tuberculosis от мышей с резистентным (дикого типа) фенотипом.

Учитывая полученные результаты, G. Govoni и P. Gros (1998) сделали вывод, что возбудители, не попадающие под контроль Nramp1, либо отличаются своим поведением внутри макрофага, либо не являются внутриклеточными паразитами. Эти данные свидетельствуют, что Nramp1 играет важную роль в резистентности к микобактериям и некоторым другим возбудителям инфекций у мышей, а его человеческий гомолог, вероятно, связан с подобными инфекциями у людей.

Такой человеческий гомолог гена Nramp1, обозначенный как NRAMP1, клонировали и картировали на человеческой хромосоме 2q 35 [Cellier M. et al., 1996]. В данном гене содержится 15 экзонов различной протяженности, разделенных интронами, размер которых также широко варьирует [Marquet S. et al., 2000]. Описано 9 полиморфных вариантов гена NRAMP1, которые, вероятно, влияют на функцию гена [Liu J. et al., 1995].

С целью изучения функции гена было проведено исследование различных полиморфизмов NRAMP1 у западных африканцев в Гамбии всвязи с туберкулезом в местной популяции. Четыре полиморфизма гена - 5`(CA)n, INT4, D543N, 3`UTR были ассоциированы с туберкулезом (р=0,03; р=0,009; р=0,008; р<0,001 соответственно). 5`(CA)n 201 п.о. аллель находился в неравновесии по сцеплению с одним из аллелей полиморфизма INT4 (Р<0,001). Полиморфизм D543N также проявил неравновесие по сцеплению с делецией в 3`UTR регионе гена (р<0,001). Аллельные варианты INT4 и 3`UTR гена NRAMP1 были незначительно связаны друг с другом и статистически значимо ассоциированы с туберкулезом [Bellamy R. et al., 1998]. Таким образом, при изучении связи NRAMP1 с туберкулезом у африканцев было обнаружено, что изменчивость данного гена связана с вариабельностью восприимчивости к туберкулезу.

Аналогичным образом, было проведено изучение различных полиморфных вариантов гена NRAMP1 в корейской популяции. Материалом для исследования послужили образцы крови от 192 пациентов с лабораторно подтвержденным туберкулезом легких. Как показал анализ, в исследуемой этнической группе туберкулез был ассоциирован с полиморфизмом 3`UTR гена NRAMP1 [Ryu S. et al., 2000].

По всей видимости, отличия в модели аллельной ассоциации гена с туберкулезом можно объяснить генетической гетерогенностью разных этнических групп. Так, например, анализ японской популяции показал различия в ассоциации гена с туберкулезом в двух группах пациентов: первая - жители города Токио, вторая - жители города Осака. Была обнаружена слабая зависимость между полиморфизмом D543N и туберкулезом в популяции Токио (р=0,045), и, напротив, имелась существенная связь с полиморфизмом (GT)n гена NRAMP1 в обеих популяциях [Gao P.S. et al., 2000]. К тому же была показана ассоциация полиморфизма D543N гена NRAMP1 с формированием деструкции при туберкулезе [Abe T. et al., 2003]. Для полиморфизмов D543N и 3`UTR найдена ассоциация с туберкулезом (р=0,041, р=0,030 соответственно) в китайской популяции [Liu W. et al., 2004].

Делись добром ;)