6.2. Хроматография “жидкость-жидкость”

В хроматографии “жидкость-жидкость” более полярные молекулы подвижной фазы “выталкивают” менее полярные молекулы анализируемого вещества к поверхности сорбента. Так как современная жидкостная хроматография в большинстве разделений использует воду, то для меры этого выталкивания используют термин “гидрофобность”. У поверхности сорбента, смеси анализируемых веществ делятся по аналогии с газо-жидкостной хроматографией с неполярными фазами, то есть позже выходят последние члены гомологического ряда.

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография (ОФЖХ) использует неполярную неподвижную фазу и полярную подвижную фазу. Нормально-фазовая жидкостная хроматография (НФЖХ) применяет неполярную подвижную фазу (н-гексан) и полярную неподвижную фазу.

В распределительной жидкостной (и газовой) хроматографии время удерживания зависит от длины (объема) колонки, линейной (объемной) скорости подвижной фазы (u) и фактора удерживания k (см. уравнение 3).

Фактор удерживания зависит от отношения объемов неподвижной V_S и подвижной фаз V_M и константы распределения K (уравнение 2).

Фактор удерживания может быть выражен через параметры растворимости подвижной (_m) и неподвижной фаз (_s).

lnk _i = (_i /RT)[lnV_S/V_m+{(_i -_m)² - (_i -_S) ²}], (33)

где _i= (E_Vi/_i)^1/2 ; _i –молярный объем анализируемого вещества (сорбата); E_Vi – энергия когезии анализируемого вещества; R –универсальная газовая постоянная; T – температура; V_S/V_m —соотношение объемов неподвижной и подвижной фаз.

Время анализа принято считать оптимальным, если компоненты анализируемой смеси элюируют из колонки при значении k в пределах от 2 до 10.

Это уравнение можно переписать в виде*:

lnk _i = (_i /RT)[lnV_S/V_m +{(_m+_s-2_i) (_m-_s)}]

Если каждую из круглых скобок приравнять нулю, то получим:

Bариант А: (_m-_s)0 _m=_s

Bариант Б: (_m+_s-2_i 0  _i =(_m-_s) /2.

Можно выбрать подвижную и неподвижную фазы (Bариант A) примерно одинаковой полярности (т. е. _m_s). Если при этом наблюдается желаемое воздействие на удерживание, полярность исследуемых образцов не играет никакой роли, и, следовательно, такой подход приводит к получению весьма неселективной фазовой системы.

В варианте Б полярность образца примерно равна половине суммы полярностей подвижной и неподвижной фаз:

 _i  (_m+_s)/2

Рисунок 22. Выбор фазовых систем для жидкостной хроматографии.

Три горизонтальные оси (сверху вниз) представляют собой параметры растворимости неподвижной фазы (_s), анализируемого образца (_i) и подвижной фазы (_m). На рисунке изображены две линии, иллюстрирующие два примера выбора возможных фазовых систем для элюирования образца с _i=12. Нормально-фазовой (НФЖХ) системе отвечает линия с положительным наклоном, которая соединяет подвижную фазу малой полярности (например, н-гексан с _m = 7) с полярной неподвижной фазой (например, силикагель _s = 16).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография (ОФЖХ) (распределительная хроматография) соответствует линии, которая соединяет типичную неполярную неподвижную фазу с _s = 7 с полярной подвижной фазой c _m =16. Такую подвижную фазу можно, например, получить, смешав метанол (_m 16) с водой (_m 25) в нужной пропорции. Наличие столь высокой полярности у воды делает обращенно-фазовую систему очень гибкой, так как эта система может перекрыть смешанными фазами (из метанола и воды или даже из тетрагидрофурана (_m 10) и воды очень широкий диапазон полярности подвижной фазы. Не меняя колонку с неподвижной фазой можно достигнуть элюирования различных анализируемых веществ. Фактор удерживания можно сдвинуть в оптимальный диапазон, выбрав подвижную фазу, еще чуть сильнее или слабее (таблица 6). Таким образом, уравнение зависимости фактора удерживания от параметров растворимости в подвижной и неподвижной фазах может служить хорошим (хотя и качественным) показателем поведения систем, используемых в жидкостной хроматографии.

В начальный период развития жидкостной хроматографии использовали сорбенты, приготовленные подобно сорбентам для газовой хроматографии. На частицы носителя механически наносили пленку неподвижной фазы с той или иной полярностью. К сожалению, колонки с такими сорбентами имели меняющиеся характеристики, и время их жизни было невелико.

При синтезе сорбентов для ВЭЖХ химическое взаимодействие

предпочтительней, чем физическое. Поверхность силикагеля обрабатывают различными хлорсиланами. При этом гидроксильные группы на его поверхности вступают в реакцию с этими хлорсиланами. Полученные продукты называют химически модифицированными кремнеземами. Количество нанесенной неподвижной фазы возрастает от С₂-С₃, до С₁₈ , то есть время удерживания возрастает приблизительно в два раза в ряду С₂→С₄→С₈→С₁₈. Если на силикагель привиты бутил, октил, октадецил, то есть неполярные группы, то такой сорбент используется в обращено-фазной хроматографии. Если привита полярная группа (например, аминогруппа), то такой сорбент используется в нормально-фазной хроматографии.

Использование параметра растворимости дает лишь приближенную оценку элюирующей силы растворителей, используемых в качестве подвижной фазы. Другую более точную оценку предложил для распределительной хроматографии Снайдер. Он ввел параметр полярности Р для распределительной хроматографии, который позволил количественно оценить полярность большинства растворителей (таблица 6).

В основе классификации полярности подвижной фазы в хроматографии жидкость-жидкость лежат экспериментально найденные значения констант распределения в хроматографии газ-жидкость. Для этанола (e), 1,4-диоксана (d) и нитрометана (n), а также н-октана () определены константы распределения для большого количества неподвижных фаз:

P = lg K_e’’ + lg K_d’’ + lg K_n’’ , (34)

При этом первый член (этанол; lg K_e’’) отражает вклад донора протонов, второй член (1,4-диоксан; lg K_d’’) отражает вклад акцептора протонов, третий член (нитрометан; lg K_n’’) отражает вклад “сильного дипольного взаимодействия”.

Значение фактора удерживания в зависимости от параметр полярности Р можно найти, используя уравнение (35):

lg(k₂/k₁) = (P₁ – P₂)/2. (35)

Чтобы получить оптимальной значение фактора удерживания пользуются обычно смесью растворителей. Полярность смесей растворителей можно рассчитать по формуле

Р_ij = Р_i N_i +Р_j N_j, (36)

где N_i и N_j - объемные доли.

При исследовании высокополярных и ионогенных соединений наблюдаются большая асимметрия пиков, слишком малое или очень большое удерживания таких соединений. Устранение этих явлений достигается введением в подвижную фазу в небольших количествах (0,01-2%) модификаторов. Модификаторы могут блокировать наиболее активные центры неподвижной фазы, могут

Таблица 6. Параметры растворителей высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Рисунок 23. Изменение формы пика и времени удерживания компонента на хроматограмме при увеличении его концентрации.

подавлять ионизацию сорбата, могут направлять сорбцию по наиболее выгодному в данном случае механизму. В качестве модификаторов для вводно-органических подвижных фаз используют соли, кислоты, основания. Использование алкилсульфатов натрия (0,001-0,01 моль/л) при рН 2-5 переводят обычную обращено-фазовую хроматографию в так называемый ион-парный режим. То же самое происходит при использовании фосфата тетрабутиламмония и бромида цетилтрибутиламмония.