Обнаружение свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов и изучение их морфологических свойств.

Цели занятия:

- овладение методикой получения накопительных культур свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов из почвенного образца;

- изучение морфологических свойств Clostridium pasterianum и Azotobacter chroococcum.

Вопросы для самоконтроля:

1. Основные части микроскопа, их назначение и устройство.

2. Порядок установки света на микроскопе.

3. Способы фиксации микропрепарата.

4. Методика приготовления препарата «висячая капля».

5. Общая характеристика роста микроорганизмов в жидких питательных средах.

6. Дайте определение накопительной культуры.

7. Основное назначение элективных сред.

8. Элективные условия для Azotobacter chroococcum.

9. Тип энергетического обмена Clostridium pasterianum.

10. Чем вызван относительно длительный период инкубации азотфиксирующих бактерий?

Вводная часть:

Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы распространены повсеместно и встречаются среди бактерий самых разных таксономических групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам, к аэробам и анаэробам.

Наиболее хорошо изученным среди свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий является азотобактер.

Azotobacter chroococcum – это соединенные в пары одиночные кокковидные клетки размером 3-7 мкм, в старой культуре клетки обычно окружены слизистой капсулой, а колонии темнеют до темно-серого и темно-коричневого цвета. Активность азотфиксации до 20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.

Элективными условиями для азотобактера, способного фиксировать азот атмосферы, являются аэрация, отсутствие в питательной среде азота и присутствие фосфора и кальция, к которым требователен азотобактер.

Наиболее изученными анаэробными свободноживущими азотфиксирующими микроорганизмами являются маслянокислые бактерии Clostridium pasterianum, активность азотфиксации которых достигает до 12 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.

Для обнаружения азотфиксирующих микроорганизмов в природных средах используют метод получения накопительных культур на природных средах, в которых отсутствует источник азота. В частности используется среда Эшби:

• маннит (глюкоза или сахароза) – 20 г/л

• K₂HPO₄ - 0,2 г/л

• MgSO₄ - 0,2 г/л

• NaCl - 0,2 г/л

• K₂SO₄ - 0,1 г/л

• CaCO₃ - 5,0 г/л

• pH=6,0-6,5

Материалы и оборудование:

Микроскоп, предметные и покровные стекла, колбы на 100 мл, пробки ватные, микробиологическая петля, спиртовка, пипетки, пробирки, термостат, держатель для пробирок, образцы почвы, р-р Люголя, жидкая питательная среда Эшби, 2%-ый р-р FeCl₃, спирт, тушь.

Задание:

1. Получить накопительную культуру свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов. Описать характер роста.

2. Приготовить фиксированный препарат из образовавшейся пленки, негативно окрашенный тушью. Микроскопировать с объективом 100х. Зарисовать.

3. Приготовить со дна накопительной культуры препарат «раздавленная капля», окрашенный раствором Люголя. Микроскопировать с объективом 40х. Зарисовать.

4. Провести качественную реакцию с хлорным железом на присутствие масляной кислоты. Описать результат реакции.

Ход работы:

Приготовление почвенного образца: образцы почвы помещаем в стерильные пробирки, непосредственно на месте их отбора. Для разрушения почвенных агрегатов используем метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 минут в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.

Нестерилизованную питательную среду разливают по 30 мл в колбы объемом 100-150 мл и вносят комочек почвы (1/2 чайной ложки), закрывают ватными пробками и термостатируют при 28-30^оС.

На 5-6 сутки на поверхности жидкости образуется бурая пленка. В некоторых случаях жидкость в колбе вспенивается и появляется запах масляной кислоты, что указывает на развитие в среде на дне колбы в анаэробных условиях бактерий Clostridium pasterianum.

Для изучения морфологических свойств микроорганизмов готовят два препарата:

• один - из пленки с поверхности среды для выделения азотобактера. Готовят фиксированный препарат, негативно окрашенный тушью. Микроскопируют с объективом 100х.

• второй – из нижних слоев жидкости для выявления клостридий. Готовят препарат «раздавленная капля» с добавлением раствора Люголя (окрашивает гранулезу). Микроскопируют с объективом 40х.

Для обнаружения масляной кислоты в среде, 5 мл жидкой среды из накопительной культуры переносят в пробирку, добавляют 2 мл 2%-ного раствора FeCl₃ и нагревают над пламенем спиртовки до кипения. Пары образующегося раствора маслянокислого железа Fe(C₄H₇COO)₃, в проходящем свете имеют кроваво-красный цвет.

Отчет по лабораторной работе должен содержать:

1. Название и цели работы.

2. Описание характера роста выращенной культуры микроорганизмов.

3. Зарисовка микропрепарата Azotobacter chroococcum.

4. Зарисовка микропрепарата Clostridium pasterianum.

5. Описание результата реакции на обнаружение масляной кислоты.

Лабораторная работа № 2.