2. Порядок установки света на микроскопе.
3. Уметь показать на микроскопе механическую, оптическую и осветительную части и рассказать об их устройстве.
4. Техника приготовления препарата «висячая капля».
5. Техника приготовления препарата «раздавленная капля».
6. Приготовление мазка и его фиксация.
7. Окраска препарата по Грамму.
8. Методика определения биологической концентрации.
9. Техника посева на жидкие и полужидкие среды.
10. Классификация питательных сред по консистенции.
Вводная часть:
Наиболее распространенным углеродным соединением в природе является целлюлоза. Целлюлоза составляет от 15 до 60% массы растений, в хлопке и льне содержание целлюлозы достигает 80-95%.
Разложение целлюлозы микроорганизмами является самым большим по масштабам естественным деструкционным процессом, звеном круговорота углерода, обеспечивающего возврат фиксированного в процессе фотосинтеза углерода в атмосферу в виде СО2.
Глобальная роль микроорганизмов в этом процессе определяется тем, что ни животные, ни растения, как правило, не способны разлагать целлюлозу. Трансформация целлюлозосодержащих соединений в природе происходит в разных условиях аэрации, температуры, рН среды.
В природе разложение целлюлозы – это сложный, комплексный процесс, происходящий при участии сообщества микроорганизмов, в состав которого входят микроорганизмы, разлагающие целлюлозу, и микроорганизмы – спутники, использующие продукты распада.
В анаэробных условиях разложение целлюлозы осуществляется анаэробными бактериями рода Clostridium. При этом образуется много органических кислот (уксусная, янтарная, молочная, масляная, муравьиная), этиловый спирт, углекислый газ и водород.
В отличие от процесса анаэробного разложения целлюлозы, который осуществляется только бактериями, в аэробных условиях клетчатку разлагают многие микроорганизмы разных систематических групп: бактерии, миксобактерии, актиномицеты, грибы.
В кислых лесных почвах главная роль в превращении целлюлозы принадлежит грибам (р. Aspergillius, Penicillium и др., базидиальные грибы).
В почвах под травянистой растительностью, в степных и луговых ландшафтах в разложении целлюлозы помимо грибов участвуют миксобактерии, актиномицеты, вибрионы р. Cellvibrio.
Разложение целлюлозы до глюкозы микробными ферментами протекает в несколько стадий и требует участия сложного ферментативного комплекса, включающего не менее четырех ферментов (см. схему).
В анаэробных условиях глюкоза сбраживается в основном по типу маслянокислого брожения. В аэробных условиях глюкоза окисляется микроорганизмами до оксикислот, а затем до конечных продуктов – углекислого газа и воды.
Материалы и оборудование:
Стерильные пробирки, стерильные фарфоровые чашечки, резиновые перчатки, чашки Петри и пробирки с питательной средой, стеклянные палочки, эксикатор, фильтровальная бумага, микроскопы, предметные и покровные стекла, спиртовки, петли бактериологические.
Задание:
-
Получить накопительную культуру целлюлозоразрушающих аэробных микроорганизмов. Подсчитать относительное количество целлюлозоразрушающих бактерий в почве. Описать морфологию их колоний. Описать морфологическое разнообразие клеток выросших микроорганизмов. Приготовить препарат «раздавленная капля». Микроскопировать с объективом 40х.
-
Получить накопительную культуру целлюлозоразрушающих анаэробных микроорганизмов. Описать характер протекающих процессов. Приготовить фиксированный препарат, окрашенный фуксином, микроскопировать с объективом 20х. Описать и зарисовать морфологию анаэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов.
Ход работы:
Для получения целлюлозоразрушающих аэробных бактерий используют среду Гетчинсона (г/л): KH2PO4 – 0,1; NaCl – 0,1; CaCl2 – 0,1; FeCl3 – 0,1; MgSO4*7H2O – 0,3; NaNO3 – 2,5; агар-агар – 2%.
Среду разливают в чашки Петри и на поверхность накладывают фильтровальную бумагу, вырезанную по размеру чашки и предварительно тоже простерилизованную.
Образцы почвы помещаем в стерильные пробирки, непосредственно на месте их отбора. Для разрушения почвенных агрегатов используем метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 минут в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.
Стеклянной палочкой с оттянутым концом на поверхность фильтра раскладывают параллельными рядами комочки почвы на расстоянии 1 см (по трафарету). Засеянные чашки Петри помещают в эксикатор над водой и ставят в термостат при 25-30оС.
Через 10-14 суток вокруг комочков почвы развиваются колонии целлюлозоразрушающих микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В местах образования колоний фильтровальная бумага разлагается, ослизняется, становится прозрачной. По морфологии можно дифференцировать колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий. Принимая общее число высеянных комочков почвы за 100%, можно подсчитать в процентах число комочков почвы, давших колонии целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Из зон разрушения клетчатки готовят препарат «раздавленная капля» и описывают выделенные различные целлюлозоразрушающие микроорганизмы.
Для накопительной культуры анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий используют среду, предложенную Имшенецким: мясо-пептонный бульон – 500 мл, CaCO3 – 2 г, фильтровальная бумага – 15 г, водопроводная вода – 500 мл.
Среду разливают в высокую пробирку. На дно опускают нарезанную полосками фильтровальную бумагу. Пробирки закрывают ватными пробками, затем пробирки стерилизуют и засевают комочком почвы. Инкубируют в течение 10-14 суток в термостате при 30-35оС для обнаружения мезофильных бактерий и при 60оС – для поиска термофильных.
Через 3-4 суток при 60оС в пробирках начинается процесс разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяется газ. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу, и оседают на дно. При 30-35оС разрушение клетчатки происходит медленнее. Разрушенные массы клетчатки подвергаются микроскопическому анализу. Готовят фиксированный препарат.
Отчет по лабораторной работе должен содержать:
1. Название и цели работы.
2. Подсчет относительного количества аэробных целлюлозоразрушающих бактерий в почве.
3. Описание морфологии колоний аэробных целлюлозоразрушающих бактерий.
4. Зарисовку микропрепарата «раздавленная капля» аэробных целлюлозоразрушающих бактерий.
5. Описание характера процессов, протекающих при анаэробном разложении целлюлозы.
6. Описание и зарисовку морфологии анаэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов.
Лабораторная работа № 3.
- Обнаружение свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов и изучение их морфологических свойств.
- Получение накопительных культур микроорганизмов, разрушающих целлюлозу (клетчатку).
- 1. Основные части микроскопа, их назначение и устройство.
- 2. Порядок установки света на микроскопе.
- Определение числа клеток кишечной палочки в колибактерине.
- Определение основных физических и химических показателей природных и сточных вод.
- Определение санитарно-микробиологических показателей качества воды.
- Бактерии, минерализующие соединения фосфора. Метод учета микроорганизмов, растворяющих ортофосфат кальция.
- Основные части микроскопа, их назначение и устройство.
- Список рекомендуемой литературы