logo
МУ Экобиотехнология

Основные части микроскопа, их назначение и устройство.

  • Техника приготовления препарата «раздавленная капля».

  • Круговорот фосфора в природе.

  • Макро-, микро- и ультромикроэлементы.

  • Функции фосфора в растительной клетке.

    Вводная часть:

    Фосфор содержится в почве, как правило, в виде труднодоступных минеральных и органических соединений, которые становятся доступными для растений только после их минерализации микроорганизмами. Минеральные вещества представлены главным образом ортофосфатами кальция (нейтральные и щелочные почвы), железа и алюминия (кислые почвы). Органические соединения фосфора встречаются в виде инозитфосфатов, фосфорсодержащих белков, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и др. Около половины органического фосфора почвы содержится в наиболее устойчивых к действию микроорганизмов фосфатах инозита (фитатах). Особенно широко распространен инозитолгексофосфат (фитин). Микроорганизмы, синтезирующие фосфатазу, способны отщеплять от органических фосфатов фосфорную кислоту, которая, взаимодействуя с катионами, переходит в соли фосфорной кислоты, доступные для растений.

    В почве не обнаружены специфические микроорганизмы, растворяющие ортофосфаты кальция, железа и алюминия. В этом процессе бактерии участвуют лишь косвенно. Так, многие микроорганизмы в процессе дыхания выделяют углекислоту, нитрифицирующие бактерии, окисляя аммоний, образуют азотистую и азотную кислоты, серобактерии, окисляя сероводород и серу, продуцируют серную кислоту. Эти кислоты взаимодействуют с фосфатами и образуют кислые соли, доступные растениям:

    Ca3(PO4)2 + 2CO2 + 2H2O = 2CaHPO4 + Ca(HCO3)2;

    Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 = Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4;

    Ca3(PO4)2 + 4HNO3 = Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2.

    Сходным образом действуют на фосфаты и бактерии, образующие органические кислоты в процессе ассимиляции углеводов.

    Одним из самых удобных методов выделения фосфатрастворяющих микроорганизмов является чашечный, когда активные микроорганизмы отбирают из колоний на агаровой пластинке в зонах растворения фосфатов. Эти зоны формируются четкими в случае, когда среда достаточно и равномерно мутна, а количество нерастворимого фосфата в ней сравнительно невелико. Поэтому наилучший эффект дает внесение в среду свежеосажденных солей.

    Для выделения из почвы бактерий, растворяющих ортофосфаты кальция, используют глюкозоаспарагиновую среду Муромцева состава (г/л): глюкоза – 10; аспарагин – 1; K2SO4 – 0,2; MgSO4 – 0,2; агар-агар – 20; кукурузный экстракт – 0,02; вода водопроводная; рН 6,8. Стерилизация при 0,5 ати 25 мин.

    Фосфаты кальция Ca3(PO4)2 вносят в питательную среду методом осаждения. Для этого в стерильную расплавленную агаризованную среду вносят (из расчета на 1 л) 3,4 г CaCl2*6H2O, а после его растворения добавляют 3,8 г Na3PO4*12H2O. Соли вносят в сухом виде, что позволяет избежать быстрого гидролиза Na3PO4 в растворе и обеспечивает постепенное взаимодействие CaCl2*6H2O и Na3PO4 по мере их растворения. На 1 л среды образуется 1,5 г свежеосажденного Ca3(PO4)2. Приготовленную таким образом питательную среду разливают в чашки Петри.

    Материалы и оборудование:

    Стерильные пробирки, стерильные фарфоровые чашечки, резиновые перчатки, чашки Петри с питательной средой Муромцева, микроскопы, предметные и покровные стекла, спиртовки, петли бактериологические, стерильные пипетки и шпателя, физ. раствор.

    Задание:

    Выделить фосфатрастворяющие микроорганизмы чашечным методом из почвенного образца. Описать морфологию их колоний. Описать морфологическое разнообразие клеток выросших микроорганизмов. Приготовить препарат «раздавленная капля». Микроскопировать с объективом 40х.

    Ход работы:

    Образцы почвы помещаем в стерильные пробирки, непосредственно на месте их отбора. Для разрушения почвенных агрегатов используем метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 минут в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.

    Приготовленную питательную среду разливают в чашки Петри, и после застывания агара засевают поверхностно 0,1 мл почвенной суспензии из разведений 10-4 – 10-7, которые готовят из 1 г почвы и 100 мл стерильной водопроводной воды (разведение 10-2). Чашки инкубируют при 28-30оС в течение 3-9 суток. По образованию зон просветления вокруг колоний активных микроорганизмов судят о растворении фосфата кальция.

    Из зон разрушения фосфата кальция готовят препарат «раздавленная капля» и описывают выделенные различные фосфатрастворяющие микроорганизмы.

    Отчет по лабораторной работе должен содержать:

    1. Название и цели работы.

    2. Основные этапы работы.

    3. Описание морфологии колоний фосфатрастворяющих бактерий.

    4.Зарисовку микропрепарата «раздавленная капля» фосфатрастворяющих бактерий.