54. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ,методКунса)

Этот метод используется для экспресс-диагностики. С его помо- щью можно выявлять как микробные антигены, так и антитела.

Прямойметод РИФ — иммунная реакция взаимодействия анти- тел с антигенами, причем антитела метят флюорохромом — ве- шеством, способным при попадании света определенной длины волны испускать кванты света также определенной длины волны. Особенность постановки этого метода заключается в необходимо- сти удаления непрореагировавших компонентов, чтобы исключить выявление неспецифического свечения. Для этого проводят от- мывание от непрореагировавших антител. Результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обра- ботанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся на тем- ном фоне по периферии клетки.

Непрямой метод РИФ используется чаще-предыдущего. Эта реакция проводится в два этапа. На первом этапе антигены взаимодейстиуют с соответствующими антителами, образуя иммунные комплексы. Все компоненты, которые не прореагировали (т.е. не в составе иммунных комплексов), должны быть удалены отмывани- ем. На втором этапе образовавшийся комплекс антиген—антитело выявляется с помощью флюорохромированной антиглобулино- вой сыворотки. В результате образуется комплекс микроб + анти- микробные кроличьи антитела + антитела к иммуноглобулинам кролика, меченные флюорохромом. Результаты оценивают с по- мощью люминесцентного микроскопа.

Иммуноферментный метод или анализ

ИФА — наиболее распространенный современный метод, ис- пользуемый для диагностики вирусных, бактериальных, прото- зойных инфекций, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов и др.

Модификаций ИФА очень много. Широко используется твердофазный неконкурентный вариант ИФА. Его проводят в 96-луночных полистироловьгх планшетах (твердая фаза). При

проведении реакции необходимо на каждом этапе отмывать непро- реагировавшие компоненты. При определении антител в лунки, на которых сорбированы антигены, вносят исследуемую сыворотку крови, затем антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом. Проявляют реакцию, добавляя субстрат для фермента. В присут- ствии фермента субстрат изменяется, причем фермснтсубстратный комплекс подбирают таким образом, чтобы образующийся в ре- акции продукт был цветным. Таким образом, при положительной реакции наблюдается изменение цвета раствора. Для определения антигенов твердофазный носитель сенсибилизируется антителами, затем последовательно вносятся исследуемый материал (антигены) и сыворотка к антигенам, меченная ферментом. Для проявления реакции вносят субстрат для фермента. Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

Радиоиммунный анализ (РИА), также радиоиммунологический или изотопный иммунологический анализ, (англ. Radioimmunoassay, RIA) — метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами, с последующей детекцией на специальных счетчиках — радиоспектрометрах.

Впервые метод был разработан Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу в 1950-х годах. С помощью этого метода они изучали клиренс инсулина у больных диабетом. Р. Ялоу получила за это Нобелевскую премию в 1977 году.

Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность.