Высаливание.

Для высаливания применяют соли в разных концентрациях.

При малой концентрации солей осаждаются наиболее крупные, тяжелые и обладающие наименьшим зарядом частицы.

При повышенной концентрации солей выпадают все более мелкие частицы и устойчивые белковые фракции.

При использовании 33%-ного раствора (NH₄)₂SO₄ выпадают белки сыворотки крови, имеющие наибольший молекулярный вес – эйглобулины, при 50%-ной концентрации – псевдоглобулины, при 100%-ной – самые «легкие» альбумины.

Белки, осажденные сульфатом аммония, почти не денатурируются; после удаления соли из белкового осадка (диализом через целлофановую мембрану) ее растворяют и используют для различных целей.

Чтобы лишить высокомолекулярные частицы устойчивости, необходимо удалить их водные оболочки и снять электрический заряд.

При электрофорезе в поддерживающих средах имеет значение размер пор геля (молекулярно-ситовой эффект геля) и размеры молекул белка.

Электрофорез на бумаге.

Сыворотку крови наносят на бумажную полоску, смоченную буфером. Концы бумажной полосы опущены в раствор электролита, где находятся электроды источника постоянного тока. При замыкании электрической цепи белковые молекулы движутся со скоростью. Пропорциональной величине заряда. За единицу времени проходят разные расстояния, т.е. оказываются на разных участках бумажной полосы.

2. Электорфорез основан на передвижении заряженной частицы в электрическом поле.

Белки сыворотки крови различаются по молекулярной массе, заряду и изоэлектрической точке. На основании этих различий белки разделяются в электрическом поле.

В зависимости от условий проведения разделения различают электрофорез на бумаге, в растворе и в геле: крахмала, целлюлозы и полиакриламидном геле.

а) Электрофорез на бумаге позволяет получить 5 белковых фракций: 1. Альбумины. 2. 1-глобулины. 3. 2-глобулины. 4. -глобулины. 5. -глобулины.

б) Электрофорез в крахмальном геле позволяет получить 10 фракций.

в) Электрофорез в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 фракций.

При электрофорезе в полиакриламидном геле используют пары буферных растворов с различными значениями рН и различной степени пористости гель.

3. Изоэлектрофокусировние – проведение электрофореза в поддерживающих средах с градиентом рН. Нахождение белка определяется его изоэлектрической точкой.

4. Иммунофорез представляет собой комбинацию электрического и иммунологического методов. Происходит электрофорез и реакция преципитации в одной среде.

Иммуноэлектрофорез – сочетание электрофореза в агаровом геле и иммунодиффузии. После электрофоретического разделения белков в канавку, идущую параллельно пути движения антигенов, вносят перциптирующую иммунную сыворотку. Антигены и антитела диффундируют на месте встречи дугообразные полосы преципитации.

Электрофорез основан на способности белков перемещаться в электрическом поле.

Для функционирования белков сыворотки крови чаще всего используют веронал-мединаловый буфер с рН 8,6. При этом значении рН белки заряжаются отрицательно и движутся к аноду.

В связи с различием в размерах молекул и в величине заряда скорость движения белков самые малые и имеющие наибольший заряд альбумины, затем -, -, и -глобулины.

Скорость передвижения белка в электрическом поле зависит от его электрофоретической подвижности.