2.4.1 Пенициллин

Йодометрический метод

Под влиянием щелочей или пенициллиназы происходит раскрытие бета-лактамного кольца в структуре антибиотика с образованием пенициллоиновой кислоты. Последняя и реагирует с йодом. По разности йода, израсходованного на взаимодействие с пенициллином до и после гидролиза молекулы антибиотика, судят о количестве препарата в исследуемых образцах.

Этот метод даёт хорошо совпадающие результаты с данными биологических методов определения активности, и он применим для большинства лекарственных форм пенициллина.

Взвешивают 25-30 мг исследуемого образца антибиотика и растворяют в фосфатном буфере (рН 6,0) до получения концентрации примерно 2000 ЕД/мл. По 2 мл полученного раствора вносят в две 125-миллилитровые колбы Эрленмейера. В первую из них добавляют 2 мл 1N раствора едкого натра и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. После этого в данную колбу вносят 2 мл 1,2 N раствора соляной кислоты и 10 мл 0,01 N йода. Через 15 мин избыток йода оттитровывают 0,01 N раствором гипосульфита натрия. В конце титрования добавляют 1 каплю раствора крахмала и продолжают титрование при энергичном встряхивании до обесцвечивания синей окраски крахмала.

Во вторую колбу добавляют 10 мл 0,01 N раствора йода и титруют сразу 0,01 N раствором гипосульфита натрия (контроль).

Активность пенициллина определяют по нижеприведённой формуле:

где У ? количество ЕД пенициллина в 1 мг;

a ? разность в титрах;

b ? активность рабочего стандарта в ЕД/мг;

c ? вес образца, мг;

F ? количество мл 0,01N раствора йода, поглощённого 1 мл рабочего стандарта натриевой соли бензилпенициллина.

Следует помнить, что расход йода при титровании зависит от температуры, рН среды, концентрации йода и других причин. Поэтому необходимо строго соблюдать условия стандартности опытов, тогда результаты будут неизменно воспроизводимыми.

Весовой метод определения бензилпенициллина

Этот метод является ориентировочным, так как характер и количество осадка зависят от условий осаждения.

Бензилпенициллин с N-этилпиперидином образует кристаллические соли, плохо растворимые в смеси ацетил-ацетона и при определённой концентрации выпадающие из раствора в виде осадка. Это позволяет определить пенициллин G не только в виде кристаллической натриевой соли, но и в смеси с другими солями пенициллина. Метод не пригоден для определения пенициллина G в смеси с пенициллином X.

Метод ультрафиолетовой спектрофотометрии

Фенильная группа в пенициллине G позволяет получать характерный максимум поглощения в ультрафиолетовом свете при 263 нм.

Хроматографичевкий метод

Смесь пенициллинов достаточно чётко разделяется на полосках хроматографической бумаги. Проявление местоположения их осуществляется по зонам задержки роста тест-микроба вокруг определённых участков полоски, наложенной на микробный газон.

Метод выполняется следующим образом.

Полоски хроматографической бумаги (35?0,5 см) пропитываются раствором фосфатного буфера (рН 6,8), представляющего смесь насыщенных растворов дигидрофосфатов калия и натрия, и подсушивают между слоями фильтровальной бумаги при окончательном досушивании на воздухе. На линию старта наносят по 1-2 мл испытуемого раствора с исходной концентрацией 800-1000 ЕД/мл. Бумагу помещают в хроматографическую банку, в лоток которой налит освобождённый от перекисей эфир, насыщенный водой (нисходящая хроматография). Банку ставят в рефрижератор на сутки. После этого бумажную ленту отрезают на 0,5 см выше линии старта и переносят на засеянные тест-микробами лотки. Лента должна плотно прилегать к агару. Лотки оставляют в термостате (37?) на 16-18 ч и затем читают результаты. Количество зон задержки роста культуры соответствует числу типов пенициллинов, а порядок чередования их на бумажной ленте зависит от коэффициента распределения. Наиболее подвижен пенициллин К (гептилпенициллин), за ним последовательно располагаются дигидропенициллин F (амилпенициллин), пенициллин F (2-пентенилпенициллин), пенициллин G (бензилпенициллин) и пенициллин Х (пара-оксибензилпенициллин0.

Чем больше зона задержки роста, тем больше в смеси того или иного типа антибиотика, количество которого можно определить следующим образом: отрезанную бумажную ленту разрезают по длине на две равные части, одну из которых помещают на агар с тест-культурой, а вторую через 16-18 ч разрезают на части соответственно зонам задержки роста. Пенициллин из обрезков извлекают водой и водные экстракты титруют чашечным методом.

Этот способ менее точен, чем описанный ранее диффузионный, а поэтому его следует расценивать лишь как ориентировочный. Тем не менее качественное определение пенициллинов хроматографическим методом распространено широко.