2.2 Химико-токсикологическое исследование тропикамида

Для идентификации тропикамида использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ), спектрофотометрию (СФМ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газо-жидкостную хроматографию с масс-селективным детектором (ГЖХ-МС).

ТСХ исследование: На хроматографическую пластинку тропикамид наносили в виде основания и помещали в камеру, предварительно насыщенную парами растворителей. Проявитель - реактив Драгендорфа. В эксперименте использовали следующие системы:

Ацетон - 25% аммиак (9:1); ацетон - хлороформ (9:1); ацетон - гексан - диэтиламин (10:10:1); хлороформ - ацетон - 25% аммиак (15:15:1); диэтиловый эфир - ацетон - 25% аммиак (10:1:0,1); бензол -96% этанол - диэтиламин (9:1:1); хлороформ - 96% этанол - 25% аммиак (80:20:4); ацетон (100%) без насыщения; этилацетат-метанол- 25% аммиак (85:10:5).

Полученные результаты хроматографического исследования тропикамида представлены в табл. 1.

Таблица 1 Значения показателей Rf тропикамида в различных хроматографических

Как видно из таблицы оптимальными системами для тропикамида являются смеси растворителей 2-4, так как значение Rf составило 0,48; 0,59; 0,56 соответственно. В случае комбинированных отравлений тропикамидом с алкалоидами опия для разделения веществ целесообразно использовать системы 6 и 9 (табл. 2) [4].

Таблица 2 Значения показателей Rf тропикамида и алкалоидов опия в частных хроматографических системах

СФМ исследование: Для исследования использовали спиртовые растворы тропикамида с концентрацией действующего вещества 10 мкг/мл. СФМ исследование проводили на спектрофотометре «Varian - Carry» в автоматическом режиме в диапазоне от 200 до 400 нм. Спектральные характеристики снимали в нейтральной, кислой и щелочной средах, добавляя к спиртовому раствору тропикамида 6н. соляной кислоты или 10% спиртового раствора гидроксида натрия.

Тропикамид имеет максимумы поглощения при длинах волн 210 нм, 255-258 нм. В спектрах поглощения тропикамида в нейтральной, кислой и щелочной средах наблюдали незначительные изменения: сдвиг в длинноволновую область (212, 258 нм) - в щелочной среде и незначительный гипсохромный сдвиг в кислой среде - 204, 254 нм. Удельный показатель поглощения тропикамида в 0,1н. соляной кислоте Е 1% в 1 см=180.

Определение тропикамида методом ГЖХ проводили с использованием газового хроматографа «Angilent Technologies 6890N Network GC System» с масс-селективным детектором модели «5973» в режиме ионизации электронным ударом (70 эВ), c автоматическим жидкостным дозатором модели «7683 В Series», при следующих условиях: колонка - кварцевая капиллярная «НР-5MS (30м х 0,252 мм», (толщина пленки фазы - 0,25 мкм); температура инжектора - 280°C; температура интерфейса детектора - 310°С; температура термостата колонки от 100°С до 280°С; увеличение температуры со скоростью 10 град/мин; газ-носитель - гелий; объем вводимой пробы - 1 мкл; деление потока 1:40.

Для полученных хроматограмм рассчитывали индексы удерживания компонентов анализируемых веществ и регистрировали их масс-спектры. Регистрацию масс-спектров компонентов хроматограмм проводили в режиме по полному ионному току. Полученные масс-спектры сравнивали с библиотечными масс-спектрами. Анализировали идентифицированные пики веществ с процентом вероятности не менее 80%. Как видно из представленной хроматограммы, тропикамид имеет время удерживания 11,7 мин. Основные характеристические ионы тропикамида - 92, 254,65,163, 121m/z (рис. 1 и 2) [13].

Рис. 1. Идентификация тропикамида методом ГЖХ с МС детектором

Рис. 2. Масс-спектр тропикамида при исследовании методом ГЖХ - МС

ВЭЖХ исследование: Раствор тропикамида с концентрацией 100 мкгмл исследовали на жидкостном хроматографе марки «Миллхром - А-02» на колонке размером 2х75 мм, с обращенной фазой «Prontosil 120-5-С18), зернением 5 мкм. Детектирование проводили при 200, 220, 250, 300 нм. В качестве подвижной фазы использовали: элюент «А» - раствор кислоты трифторуксусной (ТФУ) 0,1%, элюент «Б» - ацетонитрил 100%. Градиент от 5 до 50% при скорости потока 150 мкл/мин и температуре колонки 35 °С. В этих условиях тропикамид выходит из колонки через 7,2 минут, о чем свидетельствует пик на хроматограмме и характерный для данного вещества спектр (рис. 3).

Количественное определение тропикамида проводилось методом ВЭЖХ по калибровочному графику, построенному с использованием спиртовых растворов тропикамида концентраций 50, 100, 200 мкг/мл.

Рис. 3. Определение тропикамида методом ВЭЖХ (хроматограмма)

Влияние рН среды на степень извлечения тропикамида органическими растворителями. Для изучения влияния рН среды на степень извлечения тропикамида использовали буферные растворы со значением рН от 2 до 11,2. Буферные растворы готовили из универсальной буферной смеси, содержащей кислоту борную - 2,47г, кислоту о-фосфорную - 2,4 мл, кислоту уксусную - 2,27мл в 1 литре воды очищенной. Для получения буфера с определенным значением рН к 100 мл этой смеси добавляли различный объем раствора 0,2н гидроксида натрия. В результате проведенных экспериментов сделали вывод, что максимальное извлечение тропикамида достигается при рН водной фазы 7,9, что теоретически вполне обосновано (рКа-5,2) .

Выбор экстрагента: Для проведения исследования по выбору оптимального экстрагента использовали диэтиловый эфир, н-гексан и хлороформ (табл.3).

Таблица 3 Зависимость выхода тропикамида от характера экстрагента

Из таблицы следует, что лучшим органическим растворителем для извлечения тропикамида методом жидкость-жидкостной экстракции является хлороформ. Удовлетворительные результаты были получены и при использовании диэтилового эфира. Использование гексана нецелесообразно, ввиду его низкой экстракционной способности.

Изолирование: На модельном эксперименте сделан выбор оптимального метода изолирования тропикамида из биологического материала. Отравления тропикамидом зачастую происходят в сочетании с другими веществами (в том числе с алкалоидами опия), поэтому мы использовали методы изолирования, наиболее часто применяемые в судебно-химической практике. Выход тропикамида при изолировании подкисленной водой в среднем составил 26,4%, изолирование нейтральным ацетоном до 60% и методом кислотного гидролиза, применяемого для изолирования алкалоидов опия, лишь 18%. Однако, этот метод дает возможность использования его в случае комбинированных отравлений с алкалоидами опия.

Оптимальным элюентом при ТСХ для тропикамида является 0,1 н. раствор соляной кислоты и спирт этиловый 96%. Использование этих растворителей позволяет элюировать тропикамид до 69,8 и 86,8% соответственно.

Разработанный нами химико-токсикологический метод был апробирован на лабораторных животных. Белым крысам вводили по 5мл 1% раствора тропикамида внутрибрюшинно. У животных брали на анализ органы: стенку желудка, печень и почки, мочу. У первой крысы органы исследовали спустя 2 часа после инъекции, а у второй - спустя сутки.

Изолирование тропикамида и его метаболитов из тканей внутренних органов проводили ацетоновым методом по В.А. Карташову. Выделение тропикамида из мочи производили методом жидкость-жидкостной экстракции при рН=8 и методом кислотного гидролиза по методике для определения опиатов [11]. При исследовании извлечений методом ТСХ тропикамид был обнаружен во всех внутренних органах крыс, кроме почек второго животного, и моче. Возможные метаболиты были обнаружены только в стенке желудка второго животного и в моче после кислотного гидролиза. Исследование методом ВЭЖХ подтвердило наличие тропикамида в органах лабораторных животных (кроме почки крысы №2). Результаты ВЭЖХ исследования представлены на рис. 4.

Рис. 4 Исследование тропикамида методом ВЭЖХ (стенка желудка первой крысы)

Количественное содержание тропикамида в различных органах устанавливали методом ВЭЖХ по методике, описанной ранее. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4 Содержание тропикамида в органах лабораторных животных

Проведенные эксперименты с лабораторными животными подтверждают эффективность предложенной нами схемы химико-токсикологического анализа, и эти данные могут быть использованы в практике химических отделений бюро СМЭ.

ГЛАВА 3. Результаты анализа лекарственных веществ методом ТСХ

Для анализа методом ТСХ использовались препараты:

· Тропикамид

· Атропин

· Цикломед

Основной целью данного анализа являлся подбор лучшей системы для выполнения дальнейшего разделения препаратов методом ВЭЖХ. Анализ проводился на пластинках Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ (10х10; с УФ индикатором).

В качестве пробных систем были выбраны:

1. Эфир

2. Диоксан

3. Пропанол -2

4. Ацетон/Гексан (7:3)

5. Ацетон/Гексан (7:4)

6. Пропанол - 2/Диоксан (6:4)

7. Пропанол -2/Диоксан (7:3)

8. Пропанол -2/Диоксан (8:2)

9. Пропанол - 2/Гексан (5:5)

10. Пропанол - 2/Гексан (8:2)

11. Пропанол - 2/Гексан (9:1)

12. Пропанол - 2/Гексан (9,5:0,5)

13. Диоксан/Гексан (5:5)

14. Диоксан/Гексан (6:4)

15. Диоксан/Гексан (6:5)

16. Диоксан/Гексан (7:3)

17. Диоксан/Гексан (8:2)

18. Гексан/Диоксан/ Пропанол - 2 (5:5:1)

19. Гексан/Диоксан/ Пропанол - 2 (5:5:2)

20. Гексан/Диоксан/ Пропанол - 2 (7,5:5:1)

21. Гексан/Диоксан/ Пропанол - 2 (10:5:1)

22. Гексан/Диоксан/ Пропанол - 2 (12,5:5:1)

23. Гексан/Хлороформ/Пропанол - 2(5:5:1)

24. Гексан/Хлороформ/Пропанол - 2(6:5:1)

25. Гексан/Хлороформ/Пропанол - 2(7,5:5:1)

26. Гексан/Хлороформ/Пропанол - 2(10:5:1)

27. Гексан/Диоксан/4-х хлористый углерод (1:1:1)

28. Гексан/Диоксан/4-х хлористый углерод (1:2:1)

29. Гексан/Диоксан/4-х хлористый углерод (1:2:2)

Методика:

1. Подготовка пластинок. Обозначение линии старта, линии финиша;

2. Нанесение образцов на линию старта ручным способом: на пластинке карандашом отмечали точки, лежащие на отрезке, параллельном нижнему краю пластинки, и отстоящем от него на такое расстояние, чтобы точки не погружались в элюент (15 мм). Число точек было равно числу анализируемых образцов. Затем на отмеченные точки при помощи микрокапилляров наносили раствор анализируемых образцов, объём которых обычно был ограничен 5 мкл (объёмы растворов наносили несколькими касаниями, высушивая между ними пластинку от растворителя). На пластинку вещества наносились в следующем порядке: Атропин, Цикломед, Тропикамид.

3. Элюирование (использовалась восходящая тонкослойная хроматография): после нанесения растворов исследуемых веществ пластинку помещали в хроматографическую камеру, в которой на дне налит слой элюента. Камеру герметизировали для избежания испарения летучего элюента с поверхности пластинки в процессе хроматографирования. После того, как линия фронта достигала достаточной для анализа высоты, пластинку извлекали и высушивали.

4. Детекция: вещество поглощает в ультрафиолетовой области, поэтому детекцию осуществляли на пластинке с флуоресцентным индикатором под ультрафиолетовым излучением.

5. Оценка результатов: осуществляли выбор наиболее удачных систем, дающих возможность в последующем использовать их в методе ВЭЖХ для разделения веществ (приложение 1). Результаты были занесены в протокол.

Таким образом, в ходе данной исследовательской работы, были отобраны следующие системы:

1. Эфир

2. Пропанол-2

3. Пропанол-2/Диоксан (6:4)

4. Пропанол-2/Диоксан (8:2)

5. Пропанол-2/Гексан (9,5:0,5)

6. Диоксан/Гексан (5:5)

7. Гексан/Диоксан/Пропанол-2 (10:5:1)

8. Гексан/Диоксан/Пропанол-2 (12,5:5:1)

9. Гексан/Хлороформ/Пропанол-2 (6:5:1)

10. Гексан/Хлороформ/Пропанол-2 (7,5:5:1)

11. Гексан/Хлороформ/Пропанол-2 (10:5:1)

12. Гексан/Диоксан/4-х хлористый углерод (1:1:1)

13. Гексан/Диоксан/4-х хлористый углерод (1:2:1)

токсикологический атропин лекарственный тропикамид