IV этап

(УФ-спектрометрия λ max 265 нм λ max 235, 390 нм)

V этап

Анализ производных 1,4-бензодиазепина по 2-аминобензофенонам основан на свойстве соединений образовывать в процессе гидролиза различные по структуре 2-аминобензофеноны, их разделении в тонком слое сорбента и обнаружении на хроматограмме:

- по собственной желтой окраске;

- по азокрасителю, который образуется при сочетании соли диазония 2-аминобензофенона с β-нафтолом или N-α-нафтилэтилендиамином 2НСl (кроме 2-метиламинобензофенона, продукта гидролиза диазепама, т.к. ароматическая аминогруппа блокирована метильным (-СН3) радикалом).

В качестве дополнительного метода идентификации, подтверждающего результаты хроматографического исследования, используется спектрофотомерия в УФ-области, так как аминобензофеноны имеют характерные полосы абсорбции в области 200-400 нм. Количественная оценка содержания 1,4-бенздиазепинов проводится фотометрически по аминобензофенонам на основе реакции получения азокрасителя, с N-α-нафтилэтилен-диаминдихлоридом (реакция Браттона-Маршалла).

3.2. Этапы анализа по нативному соединению и основным метаболитам

1 этап: Извлечение, содержащее производные 1,4-бензодиазепина. Экстракция 1,4-бензодиазепинов в органический растворитель

2 этап: Исследование экстракта методом ТСХ

а) Обнаружение по окраске с реактивом Драгендорфа

Б) обнаружение по реакции образования азокрасителя после гидролиза соединений на хроматограмме.

3 этап: элюирование полосы силикагеля с пластинки, спектрофотомерия.

Исследование по нативному соединению и метаболитам дает возможностъ провести идентификацию производных 1,4-бенздиазепина внутри группы и подтвердить результаты анализа по 2-аминобензофенонам.

ТСХ аминобензофенонов производных 1,4-бенздиазепина Условия анализа:

Неподвижная фаза (сорбент): силикагель, закрепленный гипсом, нанесенный на стеклянную пластинку 9 х 12 см, или пластинки "Силуфол". Подвижная фаза: бензол

Время насыщения камеры парами растворителя – не менее 10 мин. Высота поднятия фронта растворителя – 10 см.

1.3.1. Нанесение веществ на пластинку:

На стартовую линию в 1 и 3 точки нанесите по 2 капли стандартного раствора аминобензофенонов.

Первая точка – АХБ - 2-амино-5-хлорбензофенон, АНБ - 2-амино-5-нитробензофенон

(Зона А)

Вторая точка - объект исследования (экстракт из гидролизата) (Зона Б)

Третья точка - МХБ-2-метил-5-хлорбензофенон (Зона В)

Обнаружение на хроматограмме:

- по собственной желтой окраске;

- по характерной флуоресценции в УФ-области света (254-360 нм)

- по реакции образования азокрасителя с солью дназония аминобезофенонов с щелочным раствором β-нафтола (или N-α-нафтилэтилендиамин дихлоридом).

Методика обнаружения: Обработать слой сорбента зоны А, где располагаются АНБ и АХБ реагентами в последовательности:

- 2 М раствором НСl

- 0,1% раствором NаNO2

- щелочным раствором β-нафтола или раствором N-α-нафтилэтилендиамина. Зону В, содержащую МХБ (бензофенон диазепама) обработать 10% раствором НСlO4 и наблюдать флуоресценцию в УФ-свете при 254 и 360 нм.

- Изолирование из крови и мочи Вследствие особенностей распределения и метаболизма производных 1,4-бензодиазепина, их определение целесообразно проводить по продуктам их гидролиза -аминобензофенонам.

Это позволяет определить общее количество препаратов (как сумму нативного соединения и его метаболитов) в биологической жидкости.

Методика: к 10 мл анализируемой мочи или 2 мл крови добавляют соответственно 10 мл и 2 мл концентрированной HCl и нагревают в колбе или мерной пробирке с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. По окончании реакции гидролизат нейтрализуют насыщенным раствором NaOH, доводят рН до 8-10 и экстрагируют дважды хлороформом (10 мл х 2 для мочи и 5 мл х 2 для крови). Слой органического растворителя отделяют на делительной воронке, а затем в объединенных экстрактах упаривают органический растворитель под струей теплого воздуха до объема в несколько капель для ТСХ-анализа и досуха для количественного определения.

В настоящее время, как было сказано выше, можно выделить два основных направления в анализе объектов на 1,4-бензодиазепины:

а) по продуктам гидролиза - аминобензофенонам;

б) по нативным соединениям и метаболитам.

Первое направление предусматривает в основном кислотный гидролиз 1,4-бензодиазепинов и их метаболитов после предварительной экстракции, сорбции или в процессе деструкции ткани до соответствующих аминобензофенонов с последующим использованием для их идентификации сочетания хроматографических (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) и спектральных методов.

Второе, более сложное, включает изолирование нативных соединений и ряда гидрофобных метаболитов экстракцией подкисленной водой (органы и ткани) с последующим концентрированием экстракцией органическими растворителями или сорбцией. Для биологических жидкостей используется прямая экстракция органическими растворителями при рН = 6— 8 или сорбция на полисорбе-1. Далее для обнаружения и определения бензодиазепинов и их метаболитов используется комплекс аналитических методов.

Первое направление применимо при определении препаратов Хлозепида, Нозепама, Сибазона, Феназепама, Лоразепама, в меньшей степени Нитразепама (при анализе лекарственных форм и на отдельных этапах исследования биологических объектов). Малоизученным остается данное направление по отношению к Медазепаму.

Основное преимущество исследования 1,4-бензодиазепинов по производным аминобензофенона состоит в том, что данный способ позволяет суммарно определять нативное соединение и ряд его метаболитов. Отрицательному результату анализа гидролизованных бензодиазепинов придается "отрицательное судебно-химическое значение". При положительном результате необходимо продолжать исследование по нативным соединениям, что позволит более точно установить природу яда (особенно в случае Хлозепида, Нозепама и Сибазона).

Исследование по аминобензофенонам включает в себя три основных этапа: кислотный гидролиз, экстракцию аминобензофенонов и анализ экстрактов. Объекты (остатки лекарственных форм, моча, кровь, гомогенаты органов или экстракты из них) заливают 6 М НСl и нагревают при температуре 140 — 145°С в течение 60 минут (кровь, моча, части лекарственных форм, ткани печени, почек) или 80 — 90 минут (стенки желудка или кишечника). В случае направленного исследования на Сибазон, Нозепам, Нитразепам время гидролиза можно сократить до 30 минут, а температуру уменьшить до 120°С.

Аминобензофеноны из гидролизатов экстрагируют органическими растворителями при рН = 6 -8. В случае исследования внутренних органов экстракцию проводят после предварительного отделения гидролизата (фильтрованием, центрифугированием). Экстрагенты—хлороформ-изоамиловый спирт в соотношении 100:1 (гидролизаты тканей и органов, остатков лекарственных форм) или гептан (гидролизаты крови и мочи).

Хроматография в тонких слоях (силикагель) используется в основном при исследовании внутренних органов трупа, мочи и лекарственных форм. Метод предусматривает не только разделение аминобензофенонов, но и их обнаружение по собственной окраске, флюоресценции в УФ-свете (2-метиламино-5-хлорбензофенон), образованию азокрасителя с N-а-нафтилэтилендиамином, β-нафтолом и т.п. Предел обнаружения составляет 1 — 5 мкг аминобен-зофенона в пятне.

Аминобензофеноны из зон, не обработанных реагентами, можно элюировать (спиртом или ацетоном) для снятия электронных спектров и газохроматографического исследования. Основные полосы поглощения аминобензофенонов в этаноле можно наблюдать в области 230 - 240 и 390-410 нм.

При проведении исследования на 1,4-бензодиазепины по нативным соединениям объектами являются кровь, плазма, сыворотка, моча (не менее 10 мл), ткани печени, почек (не менее 200 г), желудок и тонкий кишечник с содержимым (не менее 200 г). Изъятые объекты по возможности быстро должны быть направлены на исследование в замороженном состоянии. Консервирование этанолом не рекомендуется. Анализ биологических объектов на 1,4-бензодиазепины желательно проводить незамедлительно.

Большинство 1,4-бензодиазепинов связывается с белками крови (в основном с альбумином), их терапевтические уровни могут быть определены современными методами ГЖХ и ВЭЖХ. Данные методы с успехом используются и при анализе мочи, иногда в сочетании с хроматографией в тонких слоях. Однако надо учитывать, что если кровь (плазма, сыворотка) является особенно ценным объектом для установления терапевтической, токсической или летальной концентрации 1,4-бензодиазепинов, то информация, полученная при хроматографическом исследовании мочи, позволяет более точно установить природу бензодиазепина. Соотношение концентраций "нативное соединение/метаболит" дает возможность установить длительность нахождения его в организме. Данные хроматографических (ТСХ) исследований производных 1,4-бензодиазепина приведены в таблице.

Таблица 9 . Значения Rf 1,4-бензодиазепинов в различных системах

Обнаружение производных 1,4-бензодиазепина производят реагентами, дающими различные окраски:

а) реактив Драгендорфа в разбавленной кислоте кислоте образует оранжевые и желто-оранжевые комплексные соли;

б) реактив FPN (железа (III) хлорид в смеси хлорной и азотной кислот) окисляет бензодиазепины с образованием окрашенных продуктов желтого цвета;

в) реактив Марки образует окрашенные продукты желтого цвета;

г) подкисленный йодплатинат образует темноокрашенные пятна.

Для ГЖХ обнаружения производных 1,4-бензодиазепина и их метаболитов используется общая система: стеклянная колонка 2 м х 4мм с 2,5% SE-30 на хромосорбе Q (80— 100 меш). Хлозепид и его метаболиты имеют следующие индексы удерживания: Хлозепид — 2453, демоксепам — 2529, дезметилдиазепам — 2496, Оксазепам — 2336, Диазепам — 2425, Нитразепам — 2885, 7-ацетамидо-нитразепам ~ 3263, 7-аминонитразепам — 2900, 7-амино-З-гидроксинитразепам — 2890.

Оптимальной комбинацией в анализе производных бензодиазепина является применение в качестве:

• предварительного метода анализа – метод ПФИА с использованием пороговой концентрации 100 нг/мл,

• подтверждающего метода анализа – метод газовой хроматографиии с масс- селективным детектором или газовой хроматографии с электронно-захватным детектором,

• метода количественного определения – высокоэффективная жидкостная хроматография с диодно-матричным детектором.

Сравнительный анализ методов пробоподготовки таких как жидкость-жидкостная и твёрдофазная экстракция показал, что при использовании ТФЭ:

• сокращается время проведения серийных анализов, что важно в рутинном химико-токсикологическом и судебно-химическом анализе,

• уменьшается расход органических растворителей, а, следовательно, вредное воздействие на персонал и окружающую среду,

• повышается качество извлечений, т.к. фирмами-производителями разработан широкий спектр патронов с высокоселективными сорбентами за счет специально подобранного состава для пробоподготовки биожидкостей, содержащих различные группы лекарственных и наркотических соединений.

Сочетание твердофазной экстракции с вышеперечисленными методами анализа позволяет проводить селективную экстракцию из биожидкостей с высоким выходом определяемых веществ и воспроизводимостью результатов.