5.5.24. Производные фенотиазина

Таблица 4. Производные фенотиазина

Физико-химические свойства

Представляют собой белые или желтоватые кристаллические порошки, хорошо растворимые в воде и этаноле, получаемые синтетическим путем. Они экстрагируются органическими растворителями из щелочных водных растворов.

Основной характер производных фенотиазина обусловлен наличием в структуре молекулы гетероциклического атома азота (с рКа 4) и третичного атома азота в алифатическом радикале (рКа 9,1-9,8).

При взаимодействии с кислотами фенотиазины образуют соли, легко растворимые в воде, спирте, хлороформе, но практически нерастворимые в эфире и бензоле.

Основания представляют собой сиропообразную массу, нерастворимую в воде, но растворимую а спирте, эфире, хлороформе, этилацетате.

Логарифм распределения (log P) основания аминазина в системе октанол-вода и хлороформ-вода соответственно равны 5,16 и 1,09, хлористоводородной соли аминазина – 1,51 и 1,22. Для дипразина log P в системе циклогексан-вода и хлороформ-вода – 1,5 и 1,22.

Абсорбция производных фенотиазина в УФ-области спектра характеризуется наличием 2 максимумов: λ мах. 1. 250-260 нм (ε 35000); 2. 300-315 нм (ε 4500)

Сравнение УФ-спектров солей производных фенотиазина со спектрами их оснований показывает, что они практически идентичны. Следовательно, их УФ-спектры отражают только электронную структуру фенотиазиновой части молекулы (хлорпромазин, прометазин).

Исключение представляют те производные, которые во 2-ом положении содержат радикалы со свободными n-электронами (тиоридазин, левомепромазин).

Сульфоксиды фенотиазинов имеют в отличие от нативных (основных) соединений 4 максимума в УФ-области: 230,265,285 и 400 нм.

Фармакокинетика

Всасываются фенотиазины как вещества основного характера преимущественно из кишечника. Гидрофобный характер оснований фенотиазинов способствует взаимодействию их с белками. Кажущийся объем, распределения (Vр) приближается к 100%, поэтому, фенотиазины локализуются в тканях органов (мозг, печень, почки). Выводятся почками, в моче обнаруживается в основном в виде метаболитов.

Метаболизм фенотиазинов протекает в 3-х направлениях:

1 путь - трансформация в радикалах R1 и R2

а) N-O-S-деметилирование, которое приводит к увеличению полярности соединений;

б) окисление N10-боковой цепи.

2 путь - окисление гетероциклического атома серы в сульфоксид или сульфон Сульфоокисление - образование сульфоксидов со степенью окисления 4 и 6.

3 путь - ароматическое гидроксилирование в положениях 3, 6 с последующим конъюгированием с глюкуроновой кислотой.

Токсическая доза для производных фенотиазина в среднем колеблется от 15 до 150 мг/кг.

Анализ фенотиазинов.

Обнаружение проводят по общей схеме идентификации лекарственных соединений:

1. Реакции осаждения

Как соединения, содержащие гетероциклический атом азота, фенотиазины образуют с общеалкалоидными осадочными реактивами как простые (с пикриновой и пикролоновой кислотами), так и комплексные соли (с солью Рейнеке, с солями висмута и золота). Наиболее часто используется для обнаружения веществ основного характера раствор йода в йодиде висмута (р-в Драгендорфа).

2. Микрокристаллические реакции: аминазин и дипразин с 5% р-ром хлорного золота образуют характерные кристаллические осадки. Большинство фенотиазинов дают кристаллические осадки с солью Рейнеке, однако дифференциация отдельных представителей этой группы по форме кристаллов затруднительна.

3. Реакции окрашивания

В основе реакций окрашивания лежат следующие химические процессы: - дегидрирование в присутствии кислот (конц. серная кислота);

- каталитическое окисление (HClO4+ NaNO2, р-в Фреде, р-в Манделина и др.);

- конденсация с альдегидами в присутствии водоотнимающих средств (р-в Марки);

- окисление солями металлов с высшей степенью валентности и HPtCl4).

Таблица 5. Реакции окрашивания производных фенотиазина

ГХ-анализ

Разделение производных фенотиазина проводят на фазе средней полярности OV-225 (3-5% на хроматоне), в стеклянных микроколонках длиной 1-2 м при 200-250оС. Температура инжектора 250-300оС. Детектор азотнофосфорный (чувствительность 0,006 мкг/мкл), а для хлорсодержащих – по захвату электронов (чувствительность – 0,001). Внутренний стандарт - имизин.

Фотометрия в видимой области спектра

В основу этих методов положено измерение поглощения окрашенных продуктов реакции производных фенотиазина:

- с конц. H2SO4 – эта методика нашла наиболее широкое применение. Недостаток метода – возможность обугливания при наличии соэкстрактивных веществ, особенно при использовании гнилостно-разложившегося биологического материала (аминазин, дипразин);

- с реактивом Манделина и конц. H2SO4. Методика используется для производных фенотиазина, которые с конц. H2SO4 дают нестабильное окрашивание с невоспроизводимыми значениями оптической плотности (тиоридазин, левомепромазин);

- с 18% р-ром кислоты соляной и 1 м р-ром кислоты мышьяковой.Реакция не уступает по чувствительности первым двум методам, однако мягкие условия окисления исключают возможность обугливания соэкстрактивных веществ (тиоридазин, френолон).

Фотометрия в УФ-области спектра

Этот метод требует высокой степени очистки извлечения и обычно сочетается с ТСХ. Измерение проводят при λмах 250-255нм в раствора 0,5 М. H2SO4. Из биологического материала производные фенотиазина (соединения основного характера) выделяют этиловым спиртом, подкисленным 10%-м спиртовым раствором кислоты щавелевой (рН=2-3), очищают жидкость-жидкостной экстракцией. Анализ проводится, как и в случае 1,4-бензодиазепинов, – деструкция при 100-120 0С в течение 30-60 мин в среде 6 М. HCl, затем - экстракция в органический растворитель или метод Стаса-Отто.

Изолирование из мочи и крови

Раздельно 5-10 мл мочи и 2 мл крови подщелачивают 50% раствором едкого натра до рН 13 и смесь кипятят в течение 10 минут на водяной бане. Полученный гидролизат охлаждается до комнатной температуры и дважды (по 20 мл) извлекается н-гептаном, содержащим 3% изоамилового спирта. Гептановые извлечения из мочи объединяют, промывают водой, насыщенной гептаном и делят на две равные части. В одной части проводится обнаружение производных фенотиазина методом тонкослойной хроматографии в системах 3 и 4, а в другой – количественное определение. Экстракт из крови полностью расходуется на количественное определение, т.к. содержит меньшее количество соэкстрактивных веществ.

Хроматографичесткая очистка и обнаружение в тонких слоях

Из аликвоты органического экстракта удаляют в токе теплого воздуха органический растворитель. Сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл хлороформа и полученный раствор поровну наносят на две пластинки «Силуфол». В качестве метчиков наносят аминазин (обязательно) и те производные фенотиазина, которые были обнаружены в процессе предварительного исследования. Хроматографирование проводят в системе 1 и 2. Длина пробега – 10 см. Одну пластинку опрыскивают раствором конц. H2SO4 в этаноле (1:9) и при положительном результате на второй пластинке обнаружение проводят прокапыванием реактивом Марки.

Таблица 6. Величины и окраски пятен производных фенотиазина

Система 1: бензол-диоксан-25% аммиак – (60:35:5)

Система 2: этилацетат-ацетон-25% аммиак в этаноле (1:1) – (50:45:5)

Качественное обнаружение

1. С растворами йодида висмута в йодиде калия и фосфорно-молибденовой кислоты получаются аморфные осадки.

2. С концентрированной серной кислотой возникает устойчивое пурпурно-красное окрашивание.

При отрицательном результате двух первых реакций можно сделать заключение о необнаружении аминазина.

3. С формалинсерной кислотой аминазин дает пурпурно-красное окрашивание, усиливающееся при стоянии.

4. С концентрированной азотной кислотой возникает быстро исчезающее пурпурно-красное окрашивание.

5. С 5% раствором золотохлористоводородной кислоты (после 3—4-кратной обработки остатка основания аминазина 0,1 М. раствором НС1) выделяется темно-красный аморфный осадок, переходящий через 20-50 минут в характерный кристаллический. Кристаллы в виде палочек и сростков из них, напоминающих снопы и сфероиды. Кристаллы оптически активны, погасание косое, угол погасания 20-30°, удлинение кристаллов положительное.

Количественное определение

Количественное определение производных фенотиазина проводится без предварительной хроматографической очистки и разделения только в случае, когда установлено отсутствие в биообъекте других веществ основного характера. При их наличии для количественного определения производных фенотиазина проводят хроматографическую очистку методом ТСХ. Для этого на хроматографическую пластинку на стартовую линию, наносят в виде сплошной полосы шириной 1 см всю аликвоту экстракта для количественного определения к хроматографируют в системе 2. По окончании хроматографирования в УФ-свете отмечают зону соединения с соответствующим Rf, параллельно метчикам, снимают слой сорбента, содержащего соединение скальпелем в пробирку. Элюирование проводят 10 мл раствора 25% аммиака в этаноле (1:1) элюат отделяют фильтрованием через стеклянный фильтр № 4, упаривают досуха в токе холодного воздуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл 0,1 М. раствора HCl, затем добавляют 4 мл 0,01 М. НCl.

В случае отсутствия других веществ основного характера вторую часть гептанового извлечения (кровь, моча) реэкстрагируют 5 мл 0,1 М. HCl, а затем 4 мл 0,01 М. НCl. Солянокислые растворы объединяют.

К объединенному солянокислому раствору добавляют 12 мл ацетатного буферного раствора (рН 3,5), 2 мл насыщенного раствора метилоранжа и 5 мл хлороформа. Полученная смесь взбалтывается в делительной воронке – при наличии производных фенотиазина хлороформный слой окрашивается в желтый цвет (гелиантаты производных фенотиазина, извлекаемые хлороформом). Хлороформный слой отделяется и определяется оптическая плотность окрашенного раствора (фотоэлектроколориметр ФЭК-56 и др., кювета 10 мм, светофильтр синий с максимумом пропускания при 400 нм).

Для построения калибровочной кривой готовят стандартные растворы в 0,01 М. НСl производных фенотиазина с содержанием 1,2-10 мкг/мл производных: фенотиазина и исследуют их вышеприведенной процедурой. На основании результатов определения оптической плотности строится калибровочный график. Вышеприведенным методом изолируется до 60% производных фенотиазина из крови и до 80% из мочи.

Количественное определение аминазина и его метаболитов

1. Фотоколориметрическое определение основано на реакции с концентрированной серной кислотой. Фотометрирование проводят при λ = 508 нм; эталон сравнения – контрольный опыт. Расчет содержания аминазина и его метаболитов производится по калибровочному графику.

2. Спектрофотометрическое обнаружение. Ультрафиолетовый спектр снимается в диапазоне длин вол 220-400 нм на СФ-4, СФ-4А и др. при концентрации 10 мкг/мл в пересчете на основание.

Максимумы абсорбции неизмененного аминазина при λmax = 254-255 нм (макс.) и λmin = 300-305 нм (мин). Неизмененный аминазин обычно обнаруживается в желудке и желудочно-кишечном тракте и их содержимом. Основной метаболит – сульфоксид – имеет максимумы абсорбции при длинах волн 238-240, 273; 298 и 340 нм. Химико-токсикологическим анализом по описанной методике обнаруживается 53-60% аминазина, добавленного к органам. Граница обнаружения 0,2 мг, граница определения 0,5 мг аминазина в 100 г органов.

Обнаружение фенотиазинов

Фенотиазины часто обнаруживают с помощью тонкослойной хроматографии щелочных экстрактов мочи, но при пероральном поступлении в организм специфическая идентификация этого соединения может оказаться невозможной, если для анализа имеется только моча. Фенотиазины, принимаемые в низких дозах, например флуфеназин, невозможно обнаружить в моче ни одним из известных методов.

Качественный анализ

а) Реакции осаждения - общеалкалоидные осаждающие реактивы (часто реактив Драгендорфа) +соль Рейнеке, Bi, Au.

б) Микрокристаллические реакции - 5% раствор хлорного золота дает характерные кристаллические осадки +соль Рейнеке дает характерные кристаллические осадки

в) Реакции окрашивания:

1) Дегидрирование в присутствии концентрированных кислот (H2SO4):

Элениум – малиновое окрашивание; Тиоридазин – голубое; Левомепромазин – фиолетовое.

2) Каталитическое окисление (HСlO4+NaNO2, реактив Фреде, реактив Манделина): Элениум – малиновое окрашивание; Тиоридазин – зеленовато-голубое; Левомепромазин – фиолетовое.

3) Конденсация с альдегидами в присутствии водоотнимающих средств (реактив Марки):

Элениум – розово-малиновое окрашивание; Тиоридазин – цвет морской волны; Левомепромазин – фиолетовое.

4) окисление солями металлов, имеющих высшую степень окисления (FeCl3 и HPtCl4)

В основе теста лежит реакция многих из этих соединений с ионами трехвалентного железа в кислой среде. Предпринимается для исследования мочи, содержимого желудка и остатков веществ с места происшествия.

а) Реактив FPN (FeCl3+ HClO4+ HNO3). Цвета, варьирующие от розового, красного или оранжевого до фиолетового или синего, могут свидетельствовать о присутствии фенотиазинов или их метаболитов. Моча пациентов, регулярно принимающих в лечебных целях традиционные фенотиазины, например хлорпромазин, обычно дает положительную реакцию. Чувствительность Хлорпромазин, 25 мг/л.

б) Элениум + HPtCl4 → фиолетовый осадок; Тиоридазин – серо-розовый осадок; Левомепромазин –ярко-зеленое окрашивание.

г) Газохроматографический анализ (ГХ)

Разделение ведут в среднеполярной фазе OV-225 на хроматоне в стеклянных микроколонках l = 1-2 м при температуре 200-250 оС, температура инжектора 250-300 оС. Детектор – азотно-фосфорный; для хлорсодержащих фенотиазинов – по захвату электрона. Внутренний стандарт – имизин.

д) Фотометрия в видимой области

В основе – получение окрашенного раствора (с кислотой H2SO4, с реактивом Манделина, с 18% HCl и 1М раствором мышьяковой кислоты).

е) Фотометрия в УФ области спектра.

Метод требует высокой очистки (сочетание с ТСХ). Измерение ведут в растворе 0.5 М H2SO4 (λmax=250–255 нм)

Пример. Краткая информация для составления схемы ХТА аминазина.

Аминазин относится к производным фенотиазина. Является веществом основного характера. Аминазин всасывается преимущественно из кишечника. Локализуется в тканях мозга, печени, почек. Выводится почками, в моче обнаруживается в основном в виде метаболитов.

Метаболизм протекает в трех направлениях:

1. Окисление N10 – боковой цепи.

- CH2-CH 2-CH2-N( CH3 )2 → CH2-CH2-CH2-NH2 → дезаминирование.

2. Сульфоокисление.

3. Ароматическое гидроксилирование в 3 и 6 положениях с последующим коньюгированием с глюкуроновой кислотой.

Объекты для исследования:

1. Промывные воды желудка (если токсикант был принят внутрь, то промывные воды будут содержать его следы);

2. Желудок с содержимым, кишечник с содержимым (обнаруживаются остатки токсиканта, не успевшие всосаться в кровь);

3. Части печени, почек (аминазин метаболизируется в печени, частично выводится почками).

Аминазин относится к группе веществ, изолируемых подкисленным спиртом или подкисленной водой. Изолирование аминазина и его метаболитов рекомендуется производить спиртом, подкисленным до рН 2,0 - 3,0 10% раствором щавелевой кислоты, с последующей экстракцией основания эфиром при рН 13,0 и реэкстракцией вещества в 0,5 н раствор серной кислоты (изолирование по Е.М. Саломатину). Аминазин является соединением со слабыми основными свойствами, так как содержит в структуре третичный атом азота и при подкислении переходит в хорошо растворимую в воде и спирте ионизированную форму:

- при последующем повышении pH до 13,0 солевая форма переходит обратно в неионизированную форму, которая легко экстрагируется в эфир.

- при последующей реэкстракции раствором серной кислоты снова образуется протонированная форма аминазина.

Таким образом, за счет многократной реэкстракции происходит выделение анализируемого вещества и очистка от примесей.

Аналогично протекает извлечение из биологического материала основного метаболита аминазина – его сульфоксидного производного:

Также изолирование производных фенотиазина можно проводить путем экстракции из биологического материала подкисленной водой с последующей экстракцией органическим растворителем (диэтиловый эфир, хлороформ) из этого раствора, подщелоченного с помощью 25% раствора аммиака.

Предварительные испытания. В качестве предварительных испытаний на аминазин могут быть рекомендованы качественные реакции:

• С растворами йодида висмута в йодиде калия и фосфорно-молибденовой кислоты производные фенотиазина дают аморфные осадки

• С концентрированной серной кислотой возникает устойчивое пурпурно-красное окрашивание

• С формалином и серной кислотой производные фенотиазина дают пурпурно-красное окрашивание, усиливающееся при стоянии

• С концентрированной азотной кислотой возникает пурпурно-красное окрашивание (образование сульфоксида), которое быстро исчезает (образование сульфона).

• С 5% раствором золотохлористо-водородной кислоты аминазин (после 3-4 кратной обработки основания 0,1 М. раствором HCl) выделяется темно-красный аморфный осадок, переходящий через 20-50 мин. в характерный кристаллический осадок. Кристаллы в виде палочек и сростков из них, напоминают снопы и сфероиды. Кристаллы оптически активны (погасание косое, угол погасания 20-300, удлинение кристаллов положительное).

• С реактивами Марки и Фреде окраска производных фенотиазина — от красной до фиолетовой.

• С реактивом Манделина тизерцин дает красно-фиолетовую окраску; дипразин дает зеленую, переходящую в пурпурную окраску. Окраска у других производных фенотиазина — от красной до фиолетовой.

ТСХ-обнаружение

Для этого на хроматографическую пластинку стеклянным капилляром наносят каплю исследуемого раствора. Нанесенное пятно подсушивают на воздухе. Рядом наносят растворы известных препаратов, производных фенотиазина («свидетели») и вновь подсушивают пластинку. Затем пластинку вносят в камеру для хроматографии, насыщенную парами растворителя (смесь 25% раствора аммиака и этилового спирта в соотношении 1:1, либо 25% раствора аммиака, этилацетата и ацетона 4:90:45). После хроматографирования в указанных системах растворителей пластинку проявляют 50% раствором серной кислоты в этиловом спирте. Затем пластинку помещают на 3-5 мин в сушильный шкаф, нагретый до 1000С. Измеряют значение Rf проявившихся пятен, сравнивают их с Rf пятен «свидетелей» или со справочными значениями Rf. Аминазину соответствует значение Rf 0,35 во второй из приведенных выше систем растворителей.