5.6.8. Характеристика биологических объектов. Пробоподготовка

На стадии пробоподготовки образец очищается от примесей и загрязнений, которые не следует отбрасывать, так как они могут быть источником дополнительной информации. Пробоподготовка – стадия риска потерять анализируемое вещество и объект. Поэтому все предпринимаемые действия должны быть логически оправданы и направлены на сохранение образцов, отобранных для анализа, для дальнейшего исследования.

Моча – наиболее распространенный объект исследования на лекарственные токсичные соединения и наиболее простой биообъект для анализа вследствие низкого содержания белковых компонентов.

Важным показателем мочи как биообьекта является рН, поэтому работа с ней требует постоянного внимания к изменению рН. Величина рН мочи повышается со временем из-за действия бактериальной флоры, выделяющей аммиак. Такое увеличение можно предотвратить путем хранения ее при пониженных температурах (при анализе очень лабильных веществ – в замороженном виде). Необходимо учитывать также, что при хранении мочи в холодильнике в ней происходит новообразование этанола до концентрации 0,5 ‰. При сахарном диабете новообразование этанола в моче, хранящейся в холодильнике, доходит до 1,1‰. Вместе с тем следует помнить, что при большом объеме воздушного слоя во флаконе над кровью или мочой происходит окисление алкоголя и снижение его содержания в объекте.

Действие бактериальной флоры можно замедлить добавлением натрия фторида, кислоты борной и других бактериостатических препаратов, однако надо учитывать их дальнейшее участие в экстракции и образовании фона. Мочу можно лиофилизировать, предварительно переведя летучие соединения в соответствующие соли.

При анализе мочи и других биологических объектов на содержание одурманивающих веществ необходимо обращать внимание на потенциальные фоновые соединения как эндогенного, так и экзогенного характера, присутствие которых в анализируемом образце неизбежно при любом способе пробоподготовки.

Из потенциальных эндогенных соединений необходимо отметить присутствие низкомолекулярных продуктов метаболизма аминокислот и сахаров (амины, мочевина, карбоновые кислоты, соли карбоновых кислот и др.), небольших количеств пептидов и сахаров (в норме), стероидов, пигмента уробилина, окрашивающего мочу в желтый цвет и других веществ.

К фоновым экзогенным соединениям относятся продукты биотрансформации веществ, поступивших с пищей, и различных лекарственных веществ, используемых наркоманами для усиления наркотического эффекта, снятия синдрома абстиненции, смягчения “выхода” из состояния наркотического опьянения (барбитураты, производные 1,4-бензодиазепина), а также метаболиты других химических веществ, попавших в организм (красители, антиоксиданты, продукты табакокурения и т.д.).

На содержание эндогенных и экзогенных компонентов в пробе влияют: 1) возраст, пол и вес человека, определяющие во многом распределение яда и его метаболизм; 2) параллельное присутствие других экзогенных химических веществ (лекарственные средства, кофеин, табак, алкоголь и др.), изменяющих фармакокинетические и фармакодинамические параметры яда; 3) диета – свободные жирные кислоты связываются с альбуминами и конкурируют на этапе связывания яда с белком; 4) генетический фактор – отдельные индивидуумы обладают повышенной толерантностью к действию некоторых химических агентов; если для одних доза введенного яда является смертельной, то для других эта же доза относительно безвредна (или не вызывает летального исхода); 5) другие факторы, действие которых необходимо предусматривать, болезнь (может дать повышенный фон некоторых эндогенных соединений), работа с соединениями бытовой или индустриальной химии (повышенный фон эндо- и экзогенных веществ).

Пробоподготовка мочи может состоять из различных операций: прямое концентрирование (упаривание некоторого количества мочи до небольшого объёма на водяной бане либо роторном испарителе), экстракция растворителями, лиофилизация, хроматографическое разделение или сорбция на твердом сорбенте или комбинация различных операций (концентрирование – экстракция, лиофилизация – экстракция и др.).

Кровь. Уровень токсических веществ и их метаболитов у живых объектов и в крови трупа неодинаков вследствие биохимических изменений. Содержание токсического вещества в артериальной или венозной крови также будет различным. Даже положение тела у живого пациента – стоя, сидя или лежа – влияет на биохимический состав пробы, так как в этом случае меняется содержание белков в крови, что особенно важно для токсических веществ, в значительной степени связывающихся с белками.

Обработке экстракцией может быть подвергнута цельная кровь, плазма или сыворотка. Если для предотвращения свертывания крови использовались антикоагулянты, то необходимо учитывать, что гепарин вытесняет жирные кислоты из мест их связывания с альбумином. Это влияет, с одной стороны, на увеличение связывания токсических веществ с белками, с другой – на переход жирных кислот в органический растворитель при экстракции. Для уменьшения энзиматической активности кровь рекомендуется хранить в холодильнике в замороженном виде. Поскольку стеклянные стенки посуды содержат большое количество свободных гидроксильных групп, возможно связывание полярных токсических соединений стенками посуды за счет образования водородной связи. Это явление особенно важно учитывать при анализе следовых количеств вещества. Предварительное силилирование стенок посуды позволяет свести это явление к минимуму. Альтернативой является использование посуды из полипропилена или тефлона, хотя при этом необходимо считаться с загрязнением пробы мономерами смолы.

Из эндогенных соединений помимо жирных кислот в экстрактах из крови встречаются различные стероидные гормоны (тестостерон и др.), холестерин, которые в крови находятся в связанном состоянии с протеинами плазмы. При хранении крови более суток при комнатной температуре происходит новообразование алкоголя, достигая концентрации 1 ‰.

Слюна является продуктом секреции желез ротовой полости. Отобранную пробу центрифугируют и для хранения замораживают, чтобы замедлить активность ферментов. Хранить лучше всего слюну в склянках из тефлона или полипропилена, чтобы избежать поглощения следовых количеств анализируемого вещества стенками стеклянной посуды. Установлено, что неионизированные формы токсического вещества, находящиеся в водном растворе плазмы, пассивно диффундируют в слюну, так что существует прямая зависимость между концентрацией анализируемого вещества в слюне и его концентрацией в крови.

Волосы представляют относительно гомогенный (с точки зрения агрегатного состояния) биологический субстрат. Являясь легкодоступным для отбора, они представляют значительный интерес в качестве объекта при проведении химико-токсикологического анализа как на неорганические, так и на органические вещества. При анализе волос наркотики могут быть обнаружены в отдаленные сроки после окончания их приема и в тех случаях, когда анализ биожидкостей дает отрицательный результат. Использование волос в качестве объекта исследования позволяет проследить динамику поступления наркотического вещества в организм человека. Анализ волос длиной 6-8 см (6-8 месяцев) позволяет судить о степени наркотической зависимости.

По сравнению с биожидкостями, исследование твердых кожных образований имеет целый ряд отличительных особенностей, которые накладывают отпечаток на все этапы проведения работ. Исследование волос включает в себя две принципиально важные с точки зрения интерпретации результатов стадии: предварительное исследование поверхности волос на присутствие анализируемых веществ и проведение очистки указанной поверхности от мешающих дальнейшему исследованию веществ с обязательной проверкой эффективности данной операции. К основным методам разрушения волос относятся следующие: экстракция органическими растворителями; кислотный или щелочной гидролиз; энзиматическое разрушение; экстракция органическими растворителями при сверхкритических условиях; термическое разложение объектов.

Желчь является продуктом секреторной деятельности печени, желчного пузыря и двенадцатиперстной кишки. Эта жидкость содержит большое количество воды, эндогенных веществ, подобных тем, которые находятся в крови, плазме и сыворотке, а также желчные кислоты и пигменты. Желчь различается по величине рН (в пределах 6,7-8,3), что заставляет контролировать рН в ходе подготовки к экстракции, а при необходимости использовать подходящий буфер. Рекомендуется пробу также центрифугировать при низких скоростях (для удаления холестерина) и осадить белки добавлением смеси хлороформ – метанол (2:1) или хлороформ – изопропанол (9:2).

Печень представляет собой центральный орган химического гомеостаза. В печени находится большое разнообразие экзогенных и эндогенных веществ: продукты белкового, углеводного, жирового обменов, продукты биотрансформации экзогенных, в том числе токсических веществ. С точки зрения присутствия эндогенных и экзогенных веществ в экстракте из печени этот объект является самым неудобным вследствие их большого разнообразия. Даже самая длительная и многоэтапная экстракция, например, кислых лекарственных средств дает в хлороформном экстракте до восьми разнообразных эндогенных соединений.