5.3. Аналитический скрининг лекарственных веществ, имеющих токсикологическое значение

1. Необходимость разработки аналитических скрининговых методов анализа вызвана многообразием лекарственных соединений, которые при определенных обстоятельствах могут стать источником отравлений. Круг этих веществ постоянно расширяется по мере синтеза новых соединений.

Рост числа отравлений лекарственными препаратами связан с самолечением, в результате чего имеют место случаи передозировки лекарств, проявление их побочного действия и развитие идиосинкразии.

Большую долю в общем числе отравлений лекарственными веществами составляют детские отравления. Определенный вклад вносят отравления, связанные с наркоманией и токсикоманией.

Клиническая диагностика острых отравлений лекарственными средствами затруднена из-за нехарактерных симптомов. Особенно трудно идентифицируются комбинированные и детские отравления, где природа яда чаще неизвестна. В связи с этим возникает необходимость в разработке «скрининговых» методов анализа, которые позволяли бы за короткое время выбрать из большого числа потенциальных ядов одно или несколько веществ, послуживших причиной отравления. «Скрининг» (англ.) – отсеивание, просеивание. Таким образом, СКРИНИНГ – это научно обоснованная система поиска неизвестного яда, когда в процессе последовательных операций поэтапно отсеиваются (или определяются) отдельные группы веществ или индивидуальные вещества.

Аналитический скрининг наиболее удобен и эффективен в случае аналитической диагностики комбинированных отравлений, а также при ненаправленном анализе, когда неизвестна природа определяемого вещества. Применение аналитического скрининга позволяет систематизировать исследование и направить его в нужное русло, сократив тем самым время анализа и материальные затраты на его проведение.

К аналитическим скрининговым методам предъявляются определенные требования:

-универсальность (возможность подвергнуть исследованию большое количество веществ);

- достаточная специфичность (чаще групповая);

- высокая чувствительность (до десятых долей мкг);

- экспрессность (возможность выполнения серийных анализов);

- точность (отклонение до 10%) и воспроизводимость;

- простота и доступность;

- лабильность (возможность оптимизации и модернизации за счет введения новых соединений, материалов, реагентов и оборудования в существующую систему скрининга);

- возможность сочетания с другими методами анализа.

Перечисленным требованиям удовлетворяют, в основном, современные физико-химические методы анализа:

1. Хроматографические.

2. Спектроскопические.

3. Иммунохимические.

Эти методы могут быть использованы в системе как общего, так и частного скрининга.

Общий скрининг – предусматривает, в основном, химическое исследование веществ, отличающихся по своему строению, и принадлежащих к различным фармакологическим группам. В основном здесь применяется групповая идентификация (например, группа производных барбитуровой кислоты, фенотиазина и т.п.)

Частный скрининг – направлен на исследование веществ внутри группы и идентификацию ее отдельных представителей. Примером может служить хроматографическое исследование на производные барбитуровой кислоты для идентификации конкретного вещества из этой группы.

5.3.2.Хроматографические скрининговые методы

Хроматографию можно рассматривать как метод разделения веществ, в основе которого лежит разница в коэффициентах распределения этих веществ между неподвижной и подвижной фазами.

В настоящее время в качестве методов хроматографического скрининга наибольшее применение находят:

1. Тонкослойная хроматография (ТСХ).

2. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ).

3. Газожидкостная хроматография (ГЖХ).

4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

5.3.2.1.Тонкослойная хроматография (ТСХ)

В ТСХ роль неподвижной фазы выполняет тонкий фиксированный слой сорбента (0,1-0,5 мм), содержащий определенное количество воды, нанесенный на пластинку из стекла (алюминиевой фольги, полимера). В качестве сорбентов чаще используется силикагель и окись алюминия. Для лучшего связывания сорбента в него добавляют связующий компонент – гипс, крахмал и др. Роль подвижной фазы выполняет индивидуальный растворитель или смесь растворителей, называемые «хроматорафической системой».

В процессе хроматографирования по мере подъема растворителя вверх по пластине за счет капиллярных сил происходит разделение смеси веществ согласно их коэффициентам распределения между подвижной и неподвижной фазами.

Детектирование (обнаружение) веществ на хроматограмме проводят следующим образом:

- визуально, если вещество имеет собственную окраску (дротаверин, клозапин, бензофеноны и др.),

- в УФ-свете – для веществ, обладающих флуоресценцией (свечением) или способных поглощать УФ-излучение (темные пятна на флуоресцирующем фоне),

- с помощью хромогенных реакций: бесцветные вещества переводят в окрашенные соединения, обрабатывая хроматографическую пластинку соответствующими реактивами.

Идентификацию веществ на хроматограммах проводят по коэффициенту Rf (скорость фракционирования).

Rf – это величина, численно равная отношению длины пробега анализируемого вещества к длине пробега растворителя:

Rf = Нв-ва / Нраств.

Rf является константой вещества в заданных хроматографических условиях при их строгом соблюдении. На практике соблюдение всех условий затруднено. Величина Rf может колебаться в зависимости от целого ряда факторов:

- техники выполнения работы,

- качества и активности сорбента,

- толщина слоя сорбента,

- чистоты растворителей,

- степени насыщения камеры парами растворителей,

- температуры,

- присутствия балластных веществ и проч.

Поэтому иногда принято пользоваться не абсолютным, а относительным значением Rf, которое обозначается как Rst.

Относительный коэффициент Rst. численно равен отношению абсолютной величины Rf исследуемого вещества к Rf метчика:

Rst = Rf в-ва / Rf метчика

В качестве метчика используется вещество, принятое за стандарт. Относительное значение Rf более воспроизводимо, т.к. с изменением хроматографических условий меняются значения Rf исследуемого веществ и вещества-стандарта, а их соотношение остается достаточно стабильным. При совпадении величин Rf исследуемого веществ и вещества-стандарта можно предположить их идентичность. В условиях скрининга Rf исследуемого вещества сравнивают с табличными данными, полученными в аналогичных условиях

Метод ТСХ широко распространен благодаря своей доступности и простоте выполнения, и в то же время высокой эффективности, чувствительности, экспрессности, достаточной специфичности.

ТСХ применяется в системе общего и частного скрининга и разработана для многих лекарственных веществ, имеющих токсикологичское значение.

В общем скрининге используется множество систем растворителей, из них можно выделить некоторые:

1. Для веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера, извлекаемых органическим растворителем из кислого водного раствора – хлороформ:ацетон (9:1).

2. Для веществ основного характера, извлекаемых органическим растворителем из щелочного водного раствора: диоксан:хлороформ:ацетон:25% раствор аммиака (47,5:45:5:2,5), ацетон:хлорофром:25% раствор аммиака (245:12:1).

3. При анализе наркотических и других одурманивающих веществ, при экспресс-анализе острых отравлений используют универсальную систему толуол:ацетон:этанол:25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5).

Для детектирования веществ на хроматографической пластинке разработана схема последовательного их проявления.

Для веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера:

- УФ-облучение,

- дифенилкарбазон в хлороформе и раствор сульфата ртути: проявляются производные барбитуровой кислоты;

- раствор хлорида железа трехвалентного: проявляются производные пиразолона, салициловой кислоты, фенотиазина;

- реакив Драгендорфа и 0,5 М серная кислота: проявляются азотсодержащие вещества слабоосновного характера.

Для веществ основного характера:

- УФ-облучение,

- раствор хлорида железа трехвалентного: проявляются производные пиразолона, фенотиазина;

- раствор натрия нитрата в кислоте хлорной: проявляются производные фенотиазина, тиоксантены;

- реакив Драгендорфа и 0,5 М серная кислота: проявляются азотсодержащие вещества основного характера.

Отдельная пластинка: реактив Марки (концентрированная кислота серная, содержащая 10% формалина): проявляются, в частности алкалоиды группы опия, дифенгидрамин, некоторые производные фенотиазина и др.

При обнаружении веществ в общих системах переходят к исследованию в частных системах растворителей.

Например:

Для барбитуратов – хлороформ:н-бутанол:25% раствор аммиака (70:40:5).

Для алкалоидов опия – этилацетат:метанол:25% раствор аммиака (17:2:1).

Разработанная методика проста, универсальна, может быть использована в клинико-диагностических лабораториях и Бюро судебно-медицинской экспертизы.

С помощью ТСХ можно определять вещества в количествах от 10-9 до 10-6 г, ошибка определения компонентов – 5-10 %.

Воспроизводимость результатов исследования методом ТСХ достигается проведением их при следующих условиях:

1. Инструментальные условия проведения эксперимента, которые включают конструкцию используемой хроматографической камеры; способ ее герметизации; условия насыщения камеры парами растворителя и т.д.

2. Свойства хроматографической системы, которые включают тип и способ химической обработки использованного сорбента; величину его зернения; толщину слоя, а также тип подложки, на которую он нанесен; вид и количество внесенных в адсорбент вспомогательных веществ, таких как связующие компоненты и флуоресцирующие вещества; метод активации сорбента, например, выдерживание при повышенной температуре; способ обработки пластинки импрегнирующими буферами, щелочами или кислотами, а также веществами, модифицирующими ее свойства.

3. 3. Методические подходы к нанесению пробы и проведению хроматографирования, которые предусматривают способ нанесения образца на пластинку и использованное при этом устройство; размер начальной зоны хроматографирования; полярность растворителя, использованного для нанесения образца и его количество; продолжительность исследования и величину пробега растворителя; его состав и чистоту; температуру и влажность окружающей среды в момент проведения исследования.

Представление результатов исследований. В экспертном заключении полученные рассматриваемым методом результаты должны содержать подробное описание условий проведения эксперимента: хроматографические пластины (адсорбент, наличие или отсутствие индикатора в его составе, использованное связующее вещество, тип подложки для адсорбента, фирма – изготовитель, а также проведение специальной обработки пластин перед исследованием, например, высушивание при повышенной температуре или импрегнирование щелочью или буфером). Схема обработки хроматографических пластин должна содержать описание использованных реактивов с их полным качественным и количественным составом, последовательности проведения этапов обработки, их интенсивности и продолжительности. Особо отмечается интенсивность и окраска хроматографических зон исследуемых веществ после обработки каждым реактивом, а также величина их Rf или RRf. При проведении подтверждающих исследований на конкретное вещество допускается указание о том, что в данных конкретных условиях величина Rf и окраска хроматографической зоны исследуемого вещества использованными реактивами совпадает с величиной Rf и окраской стандартного раствора - метчика. В заключении приводятся также данные о пределе обнаружения метода.

5.3.2.2. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

ВЭТСХ появилась в начале 70-х г.г. прошлого столетия как новое направление в ТСХ. Имеет ряд преимуществ по сравнению с ТСХ:

ü более высокая эффективность (за 1 прием можно разделить около 40 веществ),

ü высокая чувствительность и экспрессность.

Высокая эффективность данного метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а более высокая чувствительность и экспрессность – более тонкого слоя сорбента (10-15 нм).

В качестве сорбентов применяются силикагель, окись алюминия, целлюлоза, метилцеллюлоза, полиамид, инактивированный силикагель и др.

Методы хроматографирования существенно не отличаются от ТСХ. Методы детектирования идентичны, только более чувствительны. Возможно проведение количественного анализа с применением метода сканирующей денситометрии, дающей точные результаты и не требующей элюирования веществ с пластинки.

ВЭТСХ, так же как и ТСХ, сочетают с другими физико-химическими методами анализа – спектральными, ГЖХ, ВЭЖХ, что повышает надежность исследования.

5.3.2.3. Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

ГЖХ нашла свое применение в анализе лекарственных веществ в качестве скринингового метода благодаря своей универсальности. Необходимым условием является переведение исследуемого вещества в летучее состояние. Метод используется при анализе барбитуратов, алкалоидов и других лекарственных веществ в качестве общего и частного скринингового.

Идентификация веществ проводится по относительным временам удерживания (или индексам удерживания Ковача). Количественное определение – по высоте (площади) пиков исследуемого вещества и вещества, применяемого в качестве внутреннего стандарта.

Достоверность исследований повышается при использовании не менее 2 колонок, обладающих различной полярностью. Используемые детекторы – пламенно-ионизационный, масс-селективный.

5.3.2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

ВЭЖХ (жидкостная хроматография высокого давления) является вариантом колоночной хроматографии, где элюент подается в колонку под высоким давлением, что ускоряет проведение анализа. Разделение веществ проводится на колонках, заполненных мелкодисперсным сорбентом.

При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используются углеводороды, иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей (нормальнофазный вариант).

В обращеннофазном варианте к силикагелю прививают гидрофобную фазу – обычно это углеводороды с большим числом углеродных атомов, например, С18, в этом случае в качестве элюента используются смеси метанола или ацетонитрила с водой или буферными растворами.

В качестве детекторов обычно применяют детектор с переменной (от 190 до 900 нм) или с фиксированной длиной волны. Могут быть использованы и другие детекторы – рефрактометрический, флуорометрический, ионизационно-пламенный, электрохимический, диодно-матричный, масс-селективный и т.п.

Выходящие из колонки вещества регистрируются на хроматограмме в виде ряда хроматографических пиков. Идентификацию веществ проводят по параметрам удерживания (время выхода) и спектральным отношениям на разных длинах волн по отношению к опорной (базовой). Количественное определение проводится по площади пика исследуемого вещества, которая прямо пропорциональна количеству вещества в пробе. При этом предварительно строится калибровочный график с использованием методов абсолютной градуировки или внутреннего стандарта.

Метод ВЭЖХ может быть использован в качестве общего и частного скрининга. Он позволяет сочетать изолирование и очистку вещества с его идентификацией и количественным определением.

Значительным преимуществом этого метода перед ГЖХ является возможность анализа термолабильных нелетучих соединений с малой и большой молекулярной массой. Особенно удобен метод ВЭЖХ для работы в клинических лабораториях токсикологических центров при исследовании билогических жидкостей.

5.3.3. Спектральные скрининговые методы

Для скрининга лекарственных средств могут быть применены:

1. Абсорбционная спектроскопия в видимой и УФ-областях спектра.

2. ИК-спектроскопия.

3. Спектроскопия ЯМР (ядерного магнитного резонанса).

4. МС (масс-спектрометрия).

Из перечисленных методов наиболее широко применяется метод абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ-областях спектра. Это связано с его доступностью и в то же время достаточной информативностью, чувствительностью.

5.3.3.1. Абсорбционная спектроскопия

Поглощение (абсорбция) веществом света, т.е. потока фотонов или электромагнитного излучения, в видимой или УФ-области спектра связано с переходом электронов внешних орбиталей (валентных электронов) из основного состояния (с меньшей энергией) в возбужденное состояние (с большей энергией). При этом энергия поглощенного фотона:

D Е = Е1- Е0, где

D Е – энергия поглощенного фотона,

Е1 – энергия электрона в возбужденном состоянии,

Е0 - энергия электрона в основном состоянии.

D Е = h .v = h . c/ l, где

h –постоянная Планка,

v – частота излучения,

v – скорость света,

l - длина волны.

Поскольку h и c – величины постоянные, очевидно, что энергия поглощенного излучения будет обратно пропорциональна l.

Согласно хромофорно-ауксохромной теории избирательным поглощением в видимой и УФ-областях спектра обладают вещества, имеющие в своей структуре определенные группы атомов – хромофоры.

Хромофоры содержат одну или несколько кратных (двойных) связей или неподеленные пары электронов, например:

C=C – этиленовая группа,

С=О – карбонильная группа,

N=O – нитрозогруппа,

N=N – диазогруппа,

C=N – азометиновая группа,

C6H6 – бензольное ядро.

Иногда в молекуле наряду с хромофорами находятся ауксохромные группы, которые не обладают собственным поглощением, но усиливают поглощение хромофоров. К таким группам относятся:

- NH2 – аминогруппа,

- OH – гидроксильная группа,

- OCH3 – метоксигруппа,

- N(CH3)2 – диметиламиногруппа,

- Cl, Br, F, I –галогены.

Идентификацию веществ в условиях скрининга проводят по спектрам поглощения. Кривая зависимости светопоглощения от длины волны l называется спектром поглощения и является качественной характеристикой вещества.

Характер спектра может меняться в зависимости от:

- природы растворителя,

- рН раствора для веществ, способных к ионизации, если молекулярная и ионизированная формы обладают различным светопоглощением.

Получение спектров поглощения в различных условиях повышает информативность метода.

Наряду с идентификацией веществ по характеру спектра можно провести их количественное определение, измеряя интенсивность поглощения в области максимума. Расчет концентрации вещества проводят по уравнению Бугера-Ламберта-Бера:

D = Е * L * C, где

D – оптическая плотность,

Е – удельный показатель поглощения 1% раствора при толщине слоя 1 см,

L – толщина светопоглощающего слоя,

C – концентрация вещества (%).

Измерение абсорбции D проводят на спектрофотометрах различных моделей, дающих монохроматическое излучение, т.к. закон Бера справедлив только для монохроматического излучения.

При проведении скрининга сравнивают спектры поглощения исследуемого вещества со спектрами эталонов.

Достоинства спектральных методов анализа:

- универсальность, позволяющая анализировать различные классы химических соединений,

- высокая чувствительность (мкг),

- информативность.

К недостаткам метода можно отнести необходимость высокой степени чистоты исследуемых веществ, поэтому рекомендуется сочетать спектральные методы анализа с предварительной очисткой веществ, например, с помощью ТСХ или других методов.

5.3.4. Иммунохимические методы в скрининге лекарственных веществ. Иммунохимический анализ (ИХА)

Современные иммунохимические методы анализа лекарственных и наркотических средств отличаются такими особенностями, как высокая чувствительность, специфичность, экспрессность, простота выполнения. Реакция проводится непосредственно в биожидкости, поэтому не требуется применять изолирования и дополнительной очистки. Методы ИХА позволяют одновременно анализировать большое число проб, поэтому они удобны для целей экспресс-диагностики.

В то же время, широкое применение этих методов сдерживается тем, что для них требуются особые реагенты (особо чистые сыворотки, ферменты и т.п.), которые необходимо закупать у иностранных поставщиков.

В основе всех методов ИХА лежит специфическая реакция «антиген – антитело», где антигеном является определяемое вещество, чужеродное для организма. При введении в живой организм чужеродного соединения (антигена АГ) образуются антитела АТ, которые сразу связываются с антигеном. Образующийся комплекс АГ+АТ выпадает в осадок. Реакция АГ+АТ является специфичной и протекает количественно, что используется и для целей количественного определения.

Для детектирования результатов реакции один из компонентов (антиген или антитело) метят специальной меткой.

Таблица 1. Зависимость природы метки и способа ее детектирования от различных видов ИХА

Существуют и некоторые другие методы. Наибольшее распространение в химико-токсикологическом анализе лекарственных и наркотических средств получили РИА и ИФА. В ИФА в качестве метки для антигенов (определяемых веществ) используются ферменты. Как правило, это различные оксидазы, способные окислять специальное химическое вещество – хромогенный субстрат, с образованием окрашенных продуктов. По интенсивности окраски и судят о количестве искомого вещества.

В РИА используется аналогичный принцип, только в качестве метки используется радиоактивный изотоп. Измеряя радиоактивность выделившегося изотопа, определяют количество искомого вещества.

5. 4. ВЕЩЕСТВА, ЭКСТРАГИРУЕМЫЕ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ ИЗ КИСЛЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ

К этой группе токсических веществ относятся барбитураты, производные ксантина, отдельные алкалоиды и некоторые другие ядовитые соединения (салициловая кислота и её производные).