14.3. Хроматографические методы.

Хроматографические методы можно рассматривать как комбинированные (гибридные) методы, в которых разделение веществ производится методами хроматографии, а регистрация и количественное определение может осуществляться спектральными, электрохимическими и другими методами. Выбор метода хроматографического анализа зависит от свойств анализируемого вещества. В химико-токсикологическом анализе широкое применение находят газо-жидкостная (ГЖХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Ранее были рассмотрены примеры определения летучих и других веществ этими методами.

ГЖХ имеет некоторые преимущества перед ВЭЖХ:

- дешевле приборы;

- колонки можно приготовить в лаборатории;

- выше чувствительность, особенно в случае применения масс-спектрального детектора, ДЭЗ;

- требуется малый объем пробы.

Однако при определении веществ этим методом требуется достаточная летучесть определяемых веществ, сложная пробоподготовка, удаление не летучих примесей, приготовление безводного раствора.

Известные способы перевода не летучих веществ в летучие сложны и трудоемки. Проведение анализа при высоких температурах колонки (200 – 300⁰С) приводит к деструкции определяемого вещества, что является причиной ошибок.

Метод ВЭЖХ позволяет анализировать водные растворы, сокращается время анализа, быстрое установление равновесия между подвижной и неподвижной фазами, отпадают ограничения по термоустойчивости, не требуется летучесть веществ. Применение специфических и неразрушающих методов детектирования позволяет, например, снимать электронные спектры отдельных фракций.

К недостаткам ВЭЖХ можно отнести: малая чувствительность детекторов, ограниченные возможности спектрофотометрического детектора (180 – 700 нм), более дорогостоящая аппаратура и сложность заполнения колонок. ВЭЖХ- методики требуют значительных количеств высокочистых органических растворителей. Очистка растворителей в лабораториях весьма трудоемкий процесс, а очищенные растворители дорогие. Чувствительность метода определяется типом используемого детектора. Наиболее чувствительными являются флуоресцентный и МС-детекторы, наиболее универсальными – спектрофотометрический.

Вариант распределительной хроматографии с обращенной фазой наиболее часто применяется и позволяет определять большое количество веществ. В качестве подвижной фазы используется водно-органические смеси, как правило, это буферные растворы с добавкой смешивающихся с водой органических растворителей (метанол, ацетонитрил, реже - ацетон).

Предложены методики прямого ВЭЖХ – определения лекарственных веществ в биологических жидкостях после предварительного осаждения белков. В настоящее время в основном применяются обращенные фазы с «пришитыми» алкильными заместителями (С₁₈, реже С₈).

Рассмотрим использование метода ВЭЖХ на примере анализа производных барбитуровой кислоты. Анализ состоит из трех основных этапов:

1. Выделение барбитуратов из биологического материала.

2. Идентификация.

3. Количественное определение.

1. Выделение барбитуратов из мочи проводится методом сорбции. 50 мл мочи подкисляют до рН 2 и пропускают через колонку с активированным полимерным сорбентом Полисорб-1. Элюирование барбитуратов с колонки проводят 20 мл этилацетата. Элюат упаривают и остаток подвергают анализу методом ВЭЖХ.

2. Идентификацию производных барбитуровой кислоты осуществляют путем их разделения на микроколонке Сепарон С-18 в токе элюента (0,05 М раствора двузамещенного фосфата аммония и метанола 60:40) с использованием УФ-детектора с регистрацией поглощения 240 нм. Барбитураты элюируются из колонки в следующей последовательности: барбитал, фенобарбитал, циклобарбитал, барбамил, этаминал натрия. Для повышения надежности идентификации в момент выхода пика определяемого соединения останавливается поток элюента и производится развертка УФ спектра в диапазоне 220-340 нм.

3. Количественное определение производится методом стандартных добавок. Предел обнаружения до 110^-8 г во вводимой пробе.

Метод ТСХ наряду с идентификацией веществ позволяет проводить и количественное определение: по интенсивности флуоресценции, по отражению или пропусканию пятна. Выпускаемые промышленностью приборы для количественного ТСХ – анализа пока труднодоступны ввиду высокой их стоимости.