14.1. Общая характеристика методов.

Для определения лекарственных веществ в биологических жидкостях используются различные методы. Идеальный метод должен обладать следующими свойствами:

высокая чувствительность,

большая избирательность,

надежность и воспроизводимость,

экспрессность,

возможность работы с малыми объемами проб,

простая пробоподготовка,

возможность автоматизации,

универсальность.

Однако идеального метода для определения лекарственных веществ в биологических жидкостях не существует. Все известные методы имеют как положительные, так и отрицательные свойства. Лучшим среди известных методов является хромато-масс-спектрометрия (ХМС). Хромато-масс-спектрометрия - гибридный метод анализа, позволяющий разделять вещества методом газожидкостной или жидкостной хроматографии, а идентификацию и количественное определение проводят методом масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия основана на определении отношения массы к заряду (m/z) ионов, а так же количества ионов, возникающих при ионизации анализируемого вещества. Ионизации подвергают вещества, находящиеся в газообразном состоянии. Проводят ионизацию разными методами (химическая ионизация, с помощью лазера, электронным ударом). При ионизации образуются как положительные, так и отрицательно заряженные ионы. Однако отрицательно заряженных ионов образуется незначительное количество и к тому же у ограниченного числа соединений. Наиболее вероятным является образование однозарядных положительных ионов. Приборы, как правило, настроены на регистрацию положительно заряженных ионов.

Образовавшиеся при ионизации ионы разделяются согласно величине m/z с помощью масс-анализатора, в котором разделение ионов происходит в магнитном или электрическом поле. В современных масс-спектрометрах для регистрации образующихся ионов чаще используются высокочувствительные электронные умножители. Зависимость ионного тока от величины m/z ионов графически представляется в виде масс-спектра вещества. Неизвестное соединение считают идентифицированным, если масс-спектр вещества в смеси совпадает с масс-спектром стандартного вещества. При этом исследование неизвестного и стандартного веществ проводят в одинаковых условиях.

Недостатки ХМС: высокая стоимость прибора, сложность проведения анализа, необходимость специально подготовленного персонала. Метод используется в качестве эталонного при точном определении концентрации лекарственных веществ.

Спектроскопические (молекулярно-абсорбционные и молекулярно- эмиссионные) методы основаны на измерении электромагнитного излучения, поглощенного или излучаемого анализируемым веществом. К этим методам относятся: спектрофотометрия в УФ и видимой областях, а также флуориметрия. Вещества, не поглощающие в УФ (200-400 нм) области, переводят в окрашенные соединения при обработке соответствующими реагентами. Фотометрические методы просты в исполнении и не отличаются высокой стоимостью.

УФ-спектрофотометрия: при облучении УФ-светом изменяются все три вида энергии молекулы (энергия электронной оболочки, колебательная и вращательная энергии). Поэтому электронные спектры многоатомных молекул весьма сложны и представляют собой широкие перекрывающиеся полосы поглощения. Форма и интенсивность полос поглощения являются дополнительными тестами при идентификации органических соединений в химико-токсикологическом анализе. Для проведения идентификации веществ по УФ-спектрам необходима предварительная очистка анализируемых веществ (ТСХ, реэкстракция). В зависимости от поведения органических веществ в УФ-области различают 3 группы:

1. Не имеющие характерного поглощения в области 200-400 нм.

2. Имеющие характерные полосы поглощения, которые не изменяются при разных значениях рН.

3. Имеющие характерные полосы поглощения, которые изменяются в зависимости от рН.

К первой группе относятся органические соединения, в молекулах которых все связи одинарные и возможны переходы типа .Такие переходы осуществляются в вакуумной УФ-области (менее 180 нм). К таким соединениям относятся пахикарпин, конин и др.

В молекулах органических веществ второй группы имеются хромофоры, не сопряженные с ауксохромными группами. Среди веществ этой группы можно отметить стероиды, соединения с бензольным кольцом. Электронный спектр бензола имеет три максимума малой интенсивности (252, 258, 263 нм), которые не изменяются при разных значениях рН. К этой группе относятся атропин, эфедрин и др. Интенсивность полос поглощения этих соединений в УФ-области незначительная (удельный показатель поглощения не превышает 10).

Молекулы соединений третьей группы содержат хромофоры и сопряженные с ними ауксохромы. При ионизации таких молекул полосы поглошения смещаются батохромно или гипсохромно. Например, при подщелачивании раствора морфина наблюдается батохромное смещение максимума ( от 284 нм до 296 нм). Подкисление раствора анилина сопровождается протонированием атома азота и появлением в спектре трех максимумов ( 249, 255 и 261 нм). Для нейтральной молекулы анилина характерен максимум поглощения в области 235 нм. В качестве примера соединений, изменяющих поглощение в зависимости от рН раствора, можно отметить барбитураты, производные 1,4-бензодиазепина. Отсутствие специфического поглощения кислых растворов барбитуратов и наличие характерных полос поглощения щелочных растворов позволяет проводить идентификацию и количественное определение барбитуратов методом УФ-спектрофотометрии.

Флуориметрия имеет ограниченное применение в химико-токсикологическом анализе, так как небольшое количество органических веществ обладает собственной флуоресценцией. Для нефлуоресцирующих веществ предложены способы перевода их в флуоресцирующие соединения с последующим измерением интенсивности флуоресценции. Флуориметрия- более чувствительный и избирательный метод по сравнению с фотометрией.

Хроматографические методы (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) позволяют быстро и точно определять в одной пробе несколько лекарственных веществ, но ГЖХ и ВЭЖХ трудоемки для широкого практического применения.

Что касается таких методов как атомно-абсорбционный и эмиссионый спектральный анализ, то они применяются в основном при определении «металлических» ядов.

В атомном спектральном анализе исследуют спектры испускания или поглощения атомов веществ. Атомизацию веществ проводят введением раствора или сухого образца в пламя, дуговой или искровой разряд. При этом часть молекул вещества распадается на отдельные атомы. Различают эмиссионный и атомно-абсорбционный спектральный анализ. Эмиссионная спектроскопия основана на измерении интенсивности спектральных линий в спектрах излучения атомов. Каждый вид атомов имеет характерные спектральные линии, а их интенсивность позволяет определить количество элемента.

Атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) основана на измерении поглощения света определенной длины волны при прохождении его через пламя, содержащее анализируемый элемент. В атомно-абсорбционной спектроскопии практически исключены спектральные помехи, связанные с наложением спектральных линий. ААС - высокочувствительный метод количественного определения более 60 элементов. Для него характерны высокая избирательность, экспрессность и хорошая воспроизводимость. Недостатки этого метода: трудность осуществления многоэлементного анализа, т.к. для каждого элемента нужен свой источник излучения; узкий диапазон определяемых концентраций.

В настоящее время наиболее часто для определения лекарственных веществ в биологических жидкостях используются фотометрические, хроматографические и белоксвязывающие методы.

14.2. Иммуноферментный и радиорецепторный методы.

В основе белоксвязывающих методов анализа лежит взаимодействие определяемого лекарственного вещества с белковой молекулой. В зависимости от характера белковой молекулы методы делятся на 2 группы:

- иммунохимические - белковой молекулой является антитело к определяемому веществу или конъюгату определяемого вещества.

- рецепторные - белковой молекулой является специфический рецептор.

1. Иммуноферментный метод анализа (ИФА).

Наиболее простым в техническом отношении иммунологическим методом анализа является иммуноферментный метод анализа. Метод основан на конкурентном взаимодействии между определяемым соединением и его конъюгатом с антителами. В настоящее время используются две разновидности метода - гомогенный (антитела находятся в растворе) и гетерогенный (антитела находятся на твердом носителе).

Преимущества метода: простота выполнения анализа, отсутствие сложного специального оборудования, высокая чувствительность.

Недостатки метода: относительно невысокая специфичность, т.к. в анализе используются обычно поликлональные антитела, короткие сроки хранения реактивов.

В настоящее время на территории СНГ применяется ИФА для определения барбитуратов, каннабиноидов и других наркотических веществ. Рассмотрим анализ каннабиноидов в моче. Небольшое количество мочи (0,5 мл) смешивают с конъюгатом тетрагидроканнабинола и пероксидазы хрена. Туда же добавляют бусинку с адсорбированными на ней поликлональными антителами на каннабиноиды. После инкубирования бусинку отмывают и заливают раствором субстрата (о-фенилендиамин) фермента. В результате энзиматической реакции между пероксидазой хрена и субстратом в раствор выделяется продукт окисления о-фенилендиамина и раствор приобретает желтый цвет. В зависимости от интенсивности поглощения света при 492 нм делают вывод о наличии в моче каннабиноидов (чем интенсивнее окраска, тем меньше было каннабиноидов в моче).

2. Радиорецепторный метод анализа (РРА).

Этот метод отличается большей чувствительностью и специфичностью, обусловленной использованием вместо поликлональных антител специфических рецепторов и радиоактивных меток.

К недостаткам метода следует отнести сложность получения специфических рецепторов (для опиатов используют рецепторы сублимированных мембран клеток головного мозга иммунизированных крыс), специального дорогостоящего оборудования (сцинциляционных -счетчиков). Сейчас в СНГ используют РРА для определения опиатов, нейролептиков и транквилизаторов. Рассмотрим методику РРА на примере определения опийных алкалоидов в моче. В пластиковый сосуд помещают суспензию мембран клеток, содержащих специфические рецепторы на опиаты, 0,5 мл мочи и 100 мкг лиганда, например, морфина, меченого тритием. После инкубирования суспензию отфильтровывают, вещество, оставшееся на фильтре, промывают буферным раствором и определяют его удельную радиоактивность. Чем больше опиатов содержалось в моче, тем меньшее количество меченого морфина связалось с рецепторами и осталось на фильтре, и следовательно, тем ниже определяемый уровень радиоактивности.

3. Поляризационный флуороиммуноанализ.

Официальным методом предварительной лабораторной диагностики злоупотреблений наркотическими средствами является метод поляризационной флуориметрии. Метод полностью автоматизирован и функции оператора сводятся к помещению капли плазмы крови в автоматический дозатор прибора и выбору соответствующей программы анализа. Этот метод объединяет конкурентное связывание определяемого лекарственного вещества (ЛВ) и ЛВ, меченого флуоресцеином, с антителом (как правило моноклональным) с поляризацией флуоресценции, что исключает стадию разделения.

Комплекс меченого лиганда с антителом (трейссер) облучается сначала вертикально, а затем горизонтально поляризованным светом и измеряется интенсивность вертикальной компоненты испускаемого света. На основании полученных результатов определяют наличие в плазме исследуемого соединения и его концентрацию.

Преимущества метода: высокая чувствительность и специфичность, хорошая воспроизводимость, большое количество определяемых соединений (около 90), например, опиаты, сердечные гликозиды, барбитураты, амфетамины, антибиотики, 1,4-бензодиазепины, производные ксантина и т.д.; полностью автоматизированый цикл анализа, занимающий 5 минут, стабильность реактивов и градуировочного графика.

Недостатки: высокая стоимость оборудования и реактивов.