10.7. Фосфорсодержащие пестициды. Общая характеристика, свойства, токсикологическое значение, изолирование, анализ.

Фосфорсодержащие органические пестициды (ФОП) являются одним из наиболее важных классов современных ядохимикатов. Они применяются в качестве инсектицидов, гербицидов, фунгицидов, дефолиантов, акарицидов, нематоцидов и др. Эти соединения отличаются высокой активностью при умеренных нормах расхода, широким спектром действия на вредителей, относительно быстрым разрушением в окружающей среде с образованием нетоксичных продуктов. В зависимости от химического строения их можно разделить на две группы: фосфорорганические соединения (атом фосфора непосредственно связан с атомом углерода) и органические соединения фосфора (атом фосфора связан с атомом углерода через кислород, серу и др.).

ФОП представляют собой либо твёрдые кристаллические вещества (хлорофос, метафос и др.), либо прозрачные бесцветные или желтовато-коричневые маслянистые жидкости, имеющие неприятный специфический запах (ДДВФ, карбофос, трихлорметафос и др.). Хорошо растворимы в неполярных органических растворителях и плохо растворимы в воде (хлорофос и некоторые другие вещества хорошо растворимы в воде). Благодаря хорошей жирорастворимости легко проникают через неповрежденную кожу, различные мембраны, гематоэнцефалический барьер.

Под действием факторов окружающей среды многие ФОП могут превращаться в более активные и токсичные продукты. Например, при 35°С за 1 сутки токсичность метилмеркаптофоса увеличивается в 30 раз. Большинство ФОП в почве, растениях и других объектах окружающей среды разлагается в течение нескольких недель.

ФОП могут проникать в организм через рот, кожу, дыхательные пути При поступлении per os всасывание начинается уже в полости рта и продолжается в желудке и тонком кишечнике. Всосавшиеся вещества быстро проникают в системный кровоток, попадают во все органы и ткани, где распределяются равномерно. Несколько более высокие концентрации могут наблюдаться в почках, печени, лёгких, кишечнике.

Преимущественно в печени ФОП в организме полностью или в значительной степени подвергаются метаболизму. Они вступают в реакции окисления (окислительной десульфурации, О-дезалкилирования, N-дезалкилирования, гидроксилирования, дегидрохлорирования), гидролиза, конъюгации. Метаболизм некоторых ФОП в организме протекает по типу летального синтеза (например, метаболиты метафоса (метилпараоксон) и карбофоса (малаоксон) в 10 тысяч раз более токсичны).

Основной способ детоксикации ФОП – ферментативный гидролиз. В результате гидролиза образуются водорастворимые вещества, удаляемые почками. В процессе гидролиза ФОП принимают участие фосфатазы, карбоксилэстеразы, карбоксиламидазы и другие ферменты. Продукты ферментативного гидролиза могут образовывать конъюгаты с глюкуроновой и серной кислотами, глютатионом.

Метаболиты ФОП выделяются с мочой, неизменённые вещества могут выделяться через дыхательные пути, а также с мочой.

Высокая токсичность ФОП объясняется угнетающим действием ФОП на ферментные системы человека и животных. Особенно важным в механизме действия ФОП на организм человека является ингибирование фермента ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Фермент ацетилхолинэстераза катализирует процесс разрушения ацетилхолина. ФОП фосфорилируют активные центры АХЭ, в результате чего она теряет способность регулировать процессы разложения ацетилхолина, что приводит к нарушению ряда функций организма.

Активный центр ацетилхолинэстеразы состоит из анионной группы –СООН, которая реагирует с четвертичной аммониевой группой в молекуле ацетилхолина, и реакционного участка, осуществляющего гидролиз сложноэфирной связи. В состав реакционного участка входит -ОН группа остатка серина, нуклеофильные свойства которой усиливаются имидазольным кольцом гистидина.

ФОП фосфорилируют –ОН группу, входящую в состав активного центра ацетилхолинэстеразы:

n-нитрофенол

Фосфорилирование ацетилхолинэстеразы протекает в несколько стадий: образование обратимого комплекса ингибитора с ферментом (доли секунды), фосфорилирование с образованием прочно фосфорилированного фермента (1-2 часа), необратимое угнетение каталитической функции фермента (4-5 часов).

Токсическое действие ФОП на организм человека проявляется следующими симптомами: судороги; беспокойство и тревога; угнетение дыхательного центра; обильное потоотделение; слезотечение; бронхорея; спазм гладкой мускулатуры бронхов, кишечника; рвота; миоз; брадикардия; периферические параличи.

Симптомы отравления обнаруживаются уже через 10-15 мин, что свидетельствует о быстром поступлении хлорофоса в кровь.

Описаны случаи смертельного ШВАЙКОВА 274

Лечение отравлений ФОП: промывание желудка (при пероральном отравлении); форсированный диурез, гемосорбция, гемодиализ, перитонеальный диализ; введение М-холиноблокаторов; реанимационная и симптоматическая терапия.

Методы изолирования ФОПиз биологических жидкостей и тканей.Выбор метода изолирования ФОП зависит как от вида биологического материала, так и от химическойструктурыи свойств ФОП.Основными растворителями для извлечения ФОПиз биологических тканей и органов является извлечение полярными органическими растворителями – ацетоном , ацетонитрилом и др. Одной из интенсивных методик изолирования ФОПзаключается в гомогенизации 10 г образца, смешивании его с силоксидом и извлечении ФОПацетонитрилом. Полученное извлечение фильтруют и смешивают с водным раствором сульфата натрия и ФОПэкстрагируют дихлорметаном. После упаривания экстрагента проводят анализ, либо, при необходимости, пробу очищают при помощи распределения в системе гексан-ацетонитрил.

Методы определения ФОПможно подразделить на предварительные – холинэстеразная проба, ТСХ (для биологических образцов), элементный анализ (для анализа технических препаратов) и подтверждающие – ГЖХ с термоионным или электронозахватным детектором.

Схема холинэстеразной пробы приведена ниже.

К исследуемому образцу крови прибавляют ацетилхолин, бромтимоловый синий (рН перехода индикатора 6,0-7,6) и инкубируют необходимое время. Если АХЭ активна, то происходит гидролиз ацетилхолина до холина и уксусной кислоты и окраска индикатора становится желтой. Если фермент блокирован, то окраска индикатора остается синей. Определение активности АХЭ выполняют также фотометрическим методом, который основан на определении не гидролизованного ацетилхолина при помощи гидроксамовой реакции. Если АХЭ ингибирована, то оптическая плотность полученного раствора высокая, т.е. ацетилхолин не гидролизован.

ТСХ ФОС выполняют с использованием малополярных подвижных фаз на силикагеле. В качестве примера таких элюентов можно привести смеси хлороформ – ацетон (9:1), гексан-ацетон в различных соотношениях (например, 4:1) и другие смеси малополярных растворителей. Проявление разделенных веществ проводят следующими реактивами:

• аммиачный раствор AgNO₃с последующим облучением УФ-светом (ФОС восстанавливают ионы серебра до металлического серебра и появляются пятна черного цвета на сером фоне, УФ-излучение используют для инициации реакции окисления).

• смесь растворов бромфенолового синего и нитрата серебра в водном ацетоне с последующей обработкой раствором лимонной кислоты (синие пятна на желтом фоне).

Газохроматографическое разделение ФОС проводят на силиконовых неподвижных жидких фазах – SE-30,OV-17 (фенилметилсиликон),OV-210 (трифторпропилметилсиликон) при температурах 150 - 220С, для более сложных ФОС – фозалон, фталофос – применяют более высокие температуры или получают более летучие производные. Детектирование чаще всего проводят с использованием термоионного детектора (разновидность пламенно-ионизационного детектора, водородное пламя горит на солевом источнике; солевой источник повышает селективность детекцииPиN). Высокочувствительными для ФОС детекторами являются также термо-аэрозольный, электронозахватный (метафос – содержит нитрогруппу, хлорофос, ДДВФ, фозалон – содержат атомы хлора).

Основной сложностью при проведении ХТА и СХА на ФОС является их высокая реакционная способность и, как следствие, быстрые и разнообразные метаболические превращения в биологических объектах. Основные пути метаболизма ФОС в организме можно разделить на 2 группы:

1 – реакции по связи P-O(P-S) - неферментативные (гидролиз – О-деалкилирование, изомеризация) и ферментативные (фосфорилирование АХЭ, гидролиз под действием других ферментов – фосфатаза, окислительное десульфирование);

2 – реакции по боковым радикалам – окисление тиоэфирной связи, гидролиз сложноэфирных, амидных и др. групп, восстановление нитрогруппы и др.

В качестве примера рассмотрим метаболизм метафоса:

Такое многообразие путей метаболизма приводит к тому, что в биологических объектах присутствуют многочисленные метаболиты с аналогичной структурой и поэтому кроме традиционных требований к газохроматографическим методикам следует добавить и высокую эффективность используемых колонок, в частности, использование капиллярных колонок. Высокая реакционная способность ФОС обуславливает быстроту их разложения в биологическом материале. После смертельного отравления метафосом (смертельная доза ингаляционно 0,02 г) содержание его в органах и крови примерно одинаково (3-11 мкг/г), в моче обнаруживается также 4-нитрофенол (0,4-13 мкг/мл). Смертельная доза карбафоса около 25 г и концентрация его в органах и биологических жидкостях выше 100 мкг/мл (в печени до 1,7 мг/г). Токсическое действие при отравлении производными тио- и дитиофосфорной кислот определяется также кетоаналогами - параоксон (метаболит метафоса) и малаоксон (метаболит карбафоса), которые более токсичны чем исходные соединения.

ХЛОРОФОС

О,О-диметил-(2,2,2-трихлор-1-гидроксиэтил)фосфонат

Хлорофос – белое кристаллическое вещество, температура плавления 84°С, растворим в воде, бензоле, хлороформе, плохо растворим в гексане.

Технический препарат представляет собой кристаллическую или пастообразную массу, содержащую около 80 % действующего вещества. При хранении кристаллизуется. Выпускается в виде смачивающегося порошка или гранул.

Медленно разрушается в кислой и более быстро в щелочной среде. Быстро разлагается в разбавленных растворах на свету.

В растворах продукты разрушения подвергаются дальнейшим превращениям. Разрушение хлорофоса усиливается в присутствии окислителей и железа, потому препарат нельзя хранить в железной таре.

Хлорофос применяется в качестве контактного или кишечного инсектицида для обработки садов, виноградников, зерновых, бахчевых. 0,1% - 0,3% раствор используется для борьбы с мухами, паразитами человека и животных.

ЛД₅₀ = 630 мг/кг. Смертельная доза хлорофоса для человека 5-10 г.

Изолирование. Хлорофос изолируют из биологических объектов подкисленной водой или смесью воды и диэтилового эфира и ацетона. Если исследуемый объект содержит жиры, их можно удалить экстракцией н-гексаном (хлорофос в данном растворителе не растворим). Далее из полученных экстрактов хлорофос экстрагируют хлороформом или метилендихлоридом.

При определении хлорофоса и других ФОП в воде проводят экстракцию хлороформом или метилендихлоридом. Полученный экстракт упаривают, остаток растворяют в ацетоне.

Качественное обнаружение. Для качественного обаружения хлорофоса применяют:

- ТСХ, ГЖХ;

- холинэстеразную пробу, в т.ч. и в сочетании с ТСХ;

- химические реакции.

При обнаружении хлорофос методом ТСХ применяют пластинки «Silufol», подвижная фаза – смесь н-гексана и ацетона (2:1). R_f(хлорофоса) = 0,32, R_f(ДДВФ) = 0,5. В качестве проявителя используют раствор нитрата серебра с последующим облучением под УФ лампой (серо-чёрные пятна на белом фоне), раствор хлорида палладия (жёлто-коричневые пятна), смесь 2% раствора резорцина и 10% раствора карбоната натрия (в соотношении 2:3 при нагревании проявляются пятна розово-красного цвета) и др.

Химические реакции, используемые для обнаружения хлорофоса можно разделить на следующие группы:

Реакции, обусловленные группой –CHCl₂:

- реакция Фудживара – при взаимодействии хлорофоса с пиридином и щелочью появляется красное или розовое окрашивание.

- реакция образования изонитрила – при нагревании хлорофоса со спиртовым раствором щелочи и анилином появляется неприятный запах изонитрила.

- реакция с резорцином – при взаимодействии хлорофоса со щелочным раствором резорцина через некоторое время появляется розовое окрашивание, которое затем переходит в оранжевое.

Аналогичный аналитический эффект дают алифатические хлорсодержащие соединения.

Реакции, обусловленные разрушением хлорофоса до дихлорацетальдегида.

- реакция с 2,4-динитрофенилгидразином – к 1-10 каплям исследуемого раствора добавляют 2 капли 1 М раствора NaOH. Через 20 мин прибавляют 1 каплю 0,1 % раствора ДНФГ в 4 М растворе HCl. Нагревают 30 мину кипящей на водяной бане. Охлаждают. Прибавляют 1 каплю 4 М раствора NaOH и 0,5 мл этанола. Появляется синее или сине-фиолетовое окрашивание.

ДДВФ (ДИХЛОФОС)

О,О-диметил-О-(2,2-дихлорвинил)фосфат

ДДВФ – один из метаболитов хлорофоса. Обладает большей токсичностью (ЛД₅₀=23-87 мг/кг). Относится к особо токсичным пестицидам.

ДДВФ – бесцветная жидкость. Мало растворима в воде (1:100), хорошо в большинстве органических растворителей. Температура кипения 35-120°С. ДДВФ – инсектицид контактного и фумигантного действия. Используется для борьбы с бытовыми насекомыми.

Изолирование. ДДВФ экстрагируют диэтиловым эфиром из кислой водной вытяжки, эфир отгоняют и проводят экстракцию хлороформом. Для извлечения ДДВФ из различных объектов применяют также метанол, этанол, ацетонитрил, этилацетат, хлороформ, метилендихлорид и др. Для очистки извлечений используют экстракцию, хроматографию, перегонку с водяным паром.

Качественное обнаружение ДДВФ проводят с применением методов и реакций, используемых для обнаружения хлорофоса.

Количественное определение. Для количественного определения хлорофоса используют хроматографические методы, фотометрию на основе реакции с 2,4-ДНФГ и др.

МЕТАФОС (МЕТИЛПАРАТИОН)

О,О-диметил-О-4-нитрофенилтиофосфат

Метафос – белое кристаллическое вещество, температура плавления 35-36°С. Мало растворяется в воде. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей.

В щелочной среде разлагается: