3. Электрофорез

а. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов — иммунодиффузии и зонального электрофореза. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; 2) проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; 3) в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; 4) разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации (см. гл. 20, п. I.А).

б. Встречный электрофорез. Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2) вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3) в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4) в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный электрофорез применяют в тех случаях, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антигены или антитела в исследуемой пробе и применяется в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний.

Г. Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам. Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты. Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки.

1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам. Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию. Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C.

2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном. Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц. Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях.

Д. Реакция связывания комплемента. Суть метода заключается в следующем: 1) антиген смешивают с антителами; 2) к образовавшимся комплексам антиген—антитело добавляют известное количество комплемента, который связывается с этими комплексами; 3) количество несвязанного комплемента оценивают в реакции гемолиза с эритроцитами барана.

Е. Твердофазный ИФА — надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента (см. гл. 20, п. I.Е).

Ж. Другие методы

1. Определение уровня C-реактивного белка. C-реактивный белок — белок острой фазы воспаления, относящийся к бета-глобулинам. C-реактивный белок, как и другие белки острой фазы воспаления, появляется в сыворотке вскоре после повреждения тканей и начала воспаления. Повышение уровня C-реактивного белка наблюдается при острых бактериальных и вирусных инфекциях, инфаркте миокарда, злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях (см. гл. 15, п. II.Б).

2. Определение титра холодовых агглютининов. Холодовые агглютинины — это IgM, которые вызывают максимальную агглютинацию эритроцитов при 4°C. Холодовые агглютинины появляются при некоторых заболеваниях, например при микоплазменной пневмонии, реже при гриппе, аденовирусной инфекции и других острых респираторных заболеваниях, а также при сонной болезни. Диагностически значимым считается выявление холодовых агглютининов в титре 1:32 или четырехкратное повышение их титра в течение 7—14 сут.

3. Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других. Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления (через 10—21 сут). Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.

4. Реакция Нейфельда — набухание клеточной стенки бактерий под действием антител к типоспецифическим капсульным полисахаридам, видимое при световой микроскопии. Эту реакцию можно наблюдать при добавлении антител, направленных против полисахаридов клеточной стенки Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis (серотипов A и C), к этим бактериям. Реакция Нейфельда применяется для исследования сыворотки и СМЖ.

5. Реакция с лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus) применяется для диагностики инфекций, прежде всего сепсиса и менингита, вызванных грамотрицательными бактериями. Метод основан на том, что при добавлении бактериальных эндотоксинов жидкий лизат амебоцитов меченосца превращается в гель.

IV. Кожные пробы, основанные на аллергических реакциях замедленного типа, — наиболее простой и доступный способ оценки клеточного иммунитета.

А. Антигены для проведения кожных проб. Кожные пробы обычно проводят с очищенным туберкулином, трихофитоном, дерматофитином 0, столбнячным анатоксином, антигенами вируса эпидемического паротита и Coccidioides immitis (см. гл. 18, п. III.Ж и табл. 22.2).

Б. Заболевания и состояния, которые сопровождаются угнетением клеточного иммунитета и, следовательно, аллергических реакций замедленного типа, перечислены ниже.

1. Первичные и вторичные иммунодефициты.

2. Острые вирусные инфекции, в том числе эпидемический паротит, краснуха, корь, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, грипп, инфекционный мононуклеоз.

3. Грибковые инфекции, например кокцидиоидоз, криптококкоз, аспергиллез.

4. Бактериальные инфекции, в том числе туберкулез, бактериальные менингит и пневмония.

5. Злокачественные новообразования.

6. Иммунизация живыми вирусными вакцинами.

7. Лечение кортикостероидами и иммунодепрессантами.

8. Аутоиммунные заболевания.

9. Большие операции.

10. Истощение.

В. Техника проведения кожных проб

1. Участок кожи для инъекции обрабатывают антисептиком.

2. Внутрикожно вводят 0,1 мл раствора антигена. Для этого используют туберкулиновый шприц объемом 1 мл и иглу 27 G длиной 12 мм.

3. Место инъекции обводят несмываемым карандашом.

4. Через 24—72 ч (в зависимости от используемого антигена) измеряют два размера эритемы и папулы, рассчитывают средний и записывают результат кожной пробы в миллиметрах.

Г. Реакция на внутрикожное введение антигена и сроки ее развития зависят от вида антигена (см. табл. 22.2).

V. Диагностика вирусных инфекций. В настоящее время широко применяются 4 способа диагностики вирусных инфекций: 1) выделение вируса в культуре клеток (наиболее точный способ); 2) выявление цитоплазматических, внутриядерных включений и гигантских многоядерных клеток в окрашенных мазках; 3) выявление не менее чем четырехкратного возрастания титра антител к вирусу на разных стадиях заболевания; 4) выявление вируса или его антигенов в тканях и биологических жидкостях с помощью экспресс-тестов.

А. Материалом для выделения вируса в культуре клеток могут служить мазки со слизистой глотки и носоглотки, мокрота, моча, кал, кровь, СМЖ, экссудат, биоптат. При взятии проб соблюдают правила асептики, пробу помещают в стерильный контейнер и транспортируют в лабораторию. При подозрении на особо опасные инфекции соблюдают дополнительные меры предосторожности и используют специальное оборудование. Выделение возбудителя в этом случае проводят в специализированных лабораториях.

Б. Соскоб со дна везикулы

1. Делают надрез скальпелем по периферии везикулы.

2. Приподнимают отслоившийся эпидермис и удаляют жидкость с помощью тампона.

3. Скальпелем делают соскоб со дна везикулы. При этом следует избегать кровотечения.

4. Полученный материал переносят на 2 чистых предметных стекла и делают 2 мазка диаметром 5—10 мм.

5. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют спиртом.

6. Фиксированные мазки окрашивают по Гимзе или обрабатывают антителами, меченными флюоресцентным красителем.

7. Для получения надежных результатов соскоб производят трижды.

В. Продукцию антител к вирусным антигенам можно оценить с помощью реакции нейтрализации, реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента и твердофазного ИФА. Пробы крови (2—10 мл) забирают на ранней стадии заболевания и спустя 2—3 нед. В стерильных условиях получают сыворотку, помещают ее в стерильную пробирку и до отправки в лабораторию хранят в холодильнике или замораживают (–20°C). Диагностически значимым считается четырехкратное повышение титра антител в ходе заболевания.

1. Реакция связывания комплемента (см. гл. 22, п. III.Д).

2. Реакция нейтрализации — высокоспецифичный метод, основанный на связывании вируса антителами и его нейтрализации. Метод позволяет определить уровень противовирусных антител и способность исследуемой сыворотки нейтрализовать вирусы. Суть метода заключается в следующем: 1) производят серийные разведения исследуемой сыворотки; 2) разные разведения сыворотки смешивают с известным количеством вируса; 3) сыворотку добавляют к культуре клеток, восприимчивой к данному вирусу; 4) нейтрализующую активность сыворотки оценивают по снижению способности вирусов инфицировать культуру клеток.

3. Реакция торможения гемагглютинации — высокоспецифичный и чувствительный метод, позволяющий определить даже незначительное количество противовирусных антител в биологических жидкостях. Этот метод основан на способности некоторых вирусов сорбироваться на эритроцитах, в частности на человеческих эритроцитах группы 0 и куриных эритроцитах, и вызывать гемагглютинацию. Если исследуемая биологическая жидкость содержит противовирусные антитела, при ее добавлении к вирусам будет наблюдаться торможение гемагглютинации. Чем выше содержание противовирусных антител в исследуемой жидкости, тем сильнее подавляется гемагглютинация.

Г. Для экспресс-диагностики вирусных инфекций применяют серологические методы, основанные на применении стандартных противовирусных антител. Эти методы перечислены ниже.

1. РИА.

2. Иммунофлюоресцентный анализ.

3. Твердофазный ИФА.

Д. Инфекционный мононуклеоз вызывает вирус Эпштейна—Барр. Заболевание обычно возникает в детском и молодом возрасте. К характерным проявлениям инфекционного мононуклеоза относятся лихорадка, боль в горле, увеличение лимфоузлов, спленомегалия, лимфоцитоз. Поскольку сходная клиническая картина наблюдается также при цитомегаловирусной инфекции, бруцеллезе, туляремии, остром токсоплазмозе и на ранних стадиях краснухи, для диагностики инфекционного мононуклеоза используют серологические методы.

1. Гетерофильные антитела — IgM, взаимодействующие с антигенами животных неродственных видов, например барана или быка. Эти антитела выявляются примерно у 90% больных инфекционным мононуклеозом. Гетерофильные антитела в низком титре могут присутствовать и у здоровых людей.

а. Проба Пауля—Буннелля — стандартный метод лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза. Он заключается в выявлении гетерофильных антител к эритроцитам барана с помощью реакции гемагглютинации. Гетерофильные антитела при инфекционном мононуклеозе отличаются от гетерофильных антител, присутствующих в сыворотке здоровых и больных сывороточной болезнью, по способности абсорбироваться тканью почек морской свинки и эритроцитами быка (см. табл. 22.3). Диагностически значимым считается титр 1:128—1:256. Гетерофильные антитела обычно обнаруживают через 3—4 нед после начала заболевания. Реакция Пауля—Буннелля бывает положительной при лейкозах, вирусных гепатитах, цитомегаловирусной инфекции, лимфоме Беркитта, ревматоидном артрите и после введения иммунных сывороток. Титр антител не отражает тяжести заболевания, однако при измерении в динамике позволяет следить за течением заболевания.

б. Экспресс-тест на гетерофильные антитела (Моно-Тест, Уэмпоул Лэборэтрис). Гетерофильные антитела в этом исследовании выявляются при агглютинации стабилизированных формалином эритроцитов лошади. Абсорбцию тканью почек морской свинки и эритроцитами быка не проводят.

2. Специальные серологические методы. Инфекционный мононуклеоз не всегда сопровождается появлением гетерофильных антител. Они, в частности, отсутствуют у детей. В этом случае применяют следующие серологические методы.

а. Антитела к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр выявляют методом иммунофлюоресценции. На ранней стадии заболевания в сыворотке больного появляются IgM к капсидному антигену. Их титр становится максимальным через 2 нед после начала заболевания и снижается в течение 2—3 мес. Присутствие IgM к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр свидетельствует о недавнем заражении, а IgG — о ранее перенесенном заболевании.

б. Антитела к ранним антигенам вируса Эпштейна—Барр выявляются методом непрямой иммунофлюоресценции. Титр этих антител становится максимальным через 2—3 нед после начала заболевания.

в. Антитела к ядерному антигену вируса Эпштейна—Барр выявляются методом непрямой иммунофлюоресценции с применением комплемента и меченых антител к нему. Антитела к ядерному антигену появляются примерно через 4 нед после начала заболевания и сохраняются на протяжении всей жизни.

Е. Вирусные гепатиты — системные инфекционные заболевания, проявляющиеся преимущественным поражением печени. Их вызывают вирусы гепатитов A, B, C, D, E, вирус Эпштейна—Барр, цитомегаловирус, вирус varicella-zoster, аденовирусы.

1. Вирус гепатита A — РНК-содержащий вирус размером 27 нм. Наиболее достоверный лабораторный признак заболевания — выявление IgM к вирусу гепатита A с помощью РИА или твердофазного ИФА. Реже используется модификация метода гемагглютинации, основанная на агглютинации эритроцитов при добавлении к ним вируса и сыворотки (источник комплемента и противовирусных антител). Диагностически значимым считается четырехкратное повышение титра противовирусных антител в течение 4 нед. Выявление вирусов в кале проводят с помощью электронной микроскопии проб, обработанных противовирусными антителами.

2. Вирус гепатита B содержит двухцепочечную ДНК, окруженную нуклеокапсидом размером 27 нм, в состав которого входит HBcAg, и внешней оболочкой, содержащей HBsAg. HBsAg обнаруживается в крови за 6 нед до появления симптомов заболевания и может выявляться длительное время как при их наличии, так и в их отсутствие (при хроническом гепатите и носительстве). На ранних стадиях заболевания этот антиген обнаруживается у 90—95% больных. Антитела к HBsAg появляются в сыворотке через 2—26 нед после исчезновения HBsAg, выявление этих антител свидетельствует о выздоровлении и развитии иммунитета. Антитела к HBcAg появляются в крови в острой стадии заболевания. Даже однократное выявление этих антител в сыворотке с высокой вероятностью указывает на острый гепатит, вызванный вирусом гепатита B. У лиц, в сыворотке которых после выздоровления длительное время сохраняется HBsAg, часто выявляются и антитела к HBcAg. Третий антиген вируса гепатита B — HBeAg — появляется обычно вслед за HBsAg в конце инкубационного периода или на ранней стадии заболевания. Появление в сыворотке HBeAg свидетельствует об остром, а выявление этого антигена в течение длительного времени — о хроническом гепатите, вызванном вирусом гепатита B. После исчезновения HBeAg в сыворотке появляются антитела к нему. Присутствие этих антител в сыворотке свидетельствует о выздоровлении, а при длительном выявлении HBsAg — о носительстве вируса гепатита B. Риск заражения от больного, в сыворотке которого одновременно выявляются HBsAg и HBeAg, в 10 раз выше, чем от больного, в сыворотке которого одновременно выявляются HBsAg и антитела к HBeAg, а HBeAg отсутствует. Выявление в сыворотке больного и HBsAg, и HBeAg свидетельствует о высоком риске заражения при контакте с этим больным. Комплексное определение антигенов вируса гепатита B и антител к ним позволяет поставить диагноз, определить стадию заболевания, оценить риск заражения и иммунный ответ.

3. Вирус гепатита C относится к РНК-содержащим вирусам. Заражение вирусом гепатита C — основная причина посттрансфузионного гепатита ни-A ни-B (70—90%). С 1990 г. стало возможным определение антител к вирусу гепатита C. Их обычно удается выявить не ранее чем через 3 мес после начала заболевания, когда начинает снижаться активность АсАТ и АлАТ. Поскольку антитела к вирусу гепатита C не выполняют защитную функцию, их появление не отражает развития иммунитета. Следует еще раз подчеркнуть, что отсутствие антител к вирусу гепатита C не исключает заболевания.

4. Вирус гепатита D состоит из дефектной РНК и HDAg, окруженных внешней оболочкой, содержащей HBsAg. Вирус гепатита D реплицируется только в присутствии вируса гепатита B и обнаруживается главным образом у наркоманов, гомосексуалистов и больных гемофилией. Этот вирус чаще, чем другие возбудители вирусного гепатита, бывает причиной молниеносного гепатита и цирроза печени. Серодиагностика гепатита D основана на применении антител к HDAg. Гепатит D исключают при рецидиве желтухи после перенесенного гепатита B.

5. Вирус гепатита E. Механизм передачи фекально-оральный. Во многих странах наблюдаются вспышки гепатита E, вызванного употреблением зараженной воды. Наборы для выявления антител к вирусу гепатита E можно приобрести в Центре по контролю заболеваемости.

Ж. ВИЧ. Для диагностики ВИЧ-инфекции используется твердофазный ИФА и иммуноблоттинг (см. гл. 19, п. I.Г.1).