Лабораторная работа № 14 Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна.

Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.

Мотивация: Билирубин  продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин  вещество токсичное, т.к. молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существуют реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени.

где УФДГК  кофермент уридиндифосфат глюкуроновая кислота, УДФГТ  фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.

Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из коньюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.

Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиновокрасная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.

Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (прямой билирубин по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильно кислой среде, при которой происходит реакция азосочетания и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (непрямой билирубин).

Реактивы и оборудование:

1. Химические пробирки, бюретки, пипетки на 10мл и 1 мл; 2. Раствор сульфаниловой кислоты 0,5%; 3. Раствор нитрита натрия 0,5% (готовится еженедельно); 4. Кофеиновый реактив: кофеина чистого 5г, бензойнокислого натрия – 37,5г, уксуснокислого натрия – 62,5г, растворяются при нагревании: раствор доводится дистиллированной водой до 1л; 5. Сыворотки крови с различными концентрациями билирубина.

Ход работы: в химическую пробирку из бюреток отмеривают 1 мл сыворотки и 2,5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0,5% раствора сульфаниловой кислоты и 0,25мл 0,5% нитрита натрия отмеривают пипеткой в пробирку из склянки на столе преподавателя. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0,5мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 минут в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм), в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.

Расчет по формуле

Х= (6,34Д) – 0,05 = мг% 17,1 = мкмоль/л

где D – оптическая плотность

0,05 – поправка на окраску диазосмеси с кофеиновым реактивом

17,1 –коэффициент перерасчета в единицах СИ

Д₁= Х₁=

Д₂= Х₂=

Вывод:

Клинико-диагностическое значение определения

общего билирубина в сыворотке крови

В крови здорового человека уровень общего билирубина равен 8,5  20,5 мкмоль/л (0,4  0,8 мг/дл), причем около 75% этого количества приходится на долю непрямого билирубина (6,4  15,4 мкмоль/л).

Повышение содержания общего билирубина более 20,5 мкмоль/л называется гипербилирубинемией и является симптомом различных физиоло-гических и патологических состояний. Гипербилирубинемия более 3035 мкмоль/л сопровождается желтушной окраской склер и кожных покровов.

Физиологическая гипербилирубинемия  это так называемая неонаталь-ная физиологическая желтуха новорожденных. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, что является следст-вием с одной стороны интенсивного гемолиза эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин (НbF), а с другой стороны, следствием незрелости гепатоцитов по захвату, коньюгации и экскреции коньюгированного билирубина.

Патологическая гипербилирубинемия может быть вызвана различными причинами, например:

 гемолитическая гипербилирубинемия (гемолитическая желтуха) является следствием массивного гемолиза эритроцитов. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, при возможном повыше-нии и коньюгированного (прямого) билирубина. В свою очередь причины гемолиза делятся на биологические (малярия, переливание крови несовмести-мой по группе или резус-фактору) и химические (действие сильных окислите-лей и других тиоловых ядов, врожденные заболевания с гемолизом, например гемоглобинопатии (серповидноклеточная анемия) и энзимопатии (в частности по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе и метгемоглобинредуктазе).

 врожденная неконьюгированная гипербилирубинемия (врожденная неге-

молитическая желтуха) является следствием метаболического дефекта в коньюгации билирубина за счет отсутствия или крайней низкой активности УДФГТ, что наблюдается при синдроме КлиглераНайяра и синдроме Жильбера. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина.

 токсическая гипербилирубинемия (паренхиматозная желтуха) является следствием поражения клеток печени вирусами (вирус гепатита А, В, С, Д, цитомегаловирус), гепатотропными ядами (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, галотан, ацетаминофен (парацетомол), изониазид, рифампицин, -аманитин (токсин бледной поганки) и др.), а также имеет место при циррозе печени (синдром гепатоцеллюлярной недостаточности). Общий билирубин повышен преимущественно за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина. Коньюгированный (прямой) билирубин может быть в норме или повышен (при цитолизе).

 коньюгированная гипербилирубинемия (обтурационная, холестатическая желтуха) является следствием механического препятствия оттоку желчи, что наблюдается при желчно-каменной болезни (калькулезный холецистит) и при наличии опухоли, перекрывающей желчевыводящие пути (опухоль главного желчевыводящего протока, опухоль головки поджелудочной железы и др.). Общий билирубин повышен за счет коньюгированного (прямого) билирубина.

 врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая идиопа-тическая желтуха) является следствием дефекта в экскреции коньюгирован-ного билирубина в желчь. Наблюдается при синдроме Дубина-Джонсона. Общий билирубин повышен за счет прямого билирубина. При гистологи-ческом исследовании ткани печени выявляется меланоз с неидентифицированным пигментом.

 врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая негемо-литическая желтуха) предположительно является следствием нарушения экскреторной функции печени, наблюдается при синдроме Ротора, при гистологическом исследовании ткани печени патологических изменений не находят.

Неконьюгированный билирубин может проходить гематоэнцефалический барьер в случае его повышенного содержания в крови и приводить к пораже-нию мозга (ядерная желтуха). Для предотвращения развития энцефалопатии применяют индукторы УДФГТ (фенобарбитал, люминал), например для коррекции состояния у недоношенных новорожденных детей.

Тестовый контроль по теме: Химия крови.

Обмен хромопротеинов 

Тест 1

Выберите правильнЫй ответ

Непрямой билирубин превращается в прямой билирубин связываясь:

а) с сывороточным альбумином

б) в печени с бензойной кислотой

в) в печени с ФАФС (3-фосфоаденин 5-фосфосульфат)

г) в печени с уридинфосфоглюкуроновой кислотой (УДФ ГК)

д) в кишечнике с УДФ ГК

Тест 2

Выберите правильнЫй ответ

Причиной порфирий является:

а) нарушение синтеза гема

б) нарушение синтеза глобина

в) нарушение синтез билирубина

г) нарушение образования в кишечнике уробилиногена, стеркобилино-гена и стеркобилина

д) нарушение проницаемости мембран эритроцита

Тест 3

Выберите правильнЫй ответ

Миоглобин состоит из:

а) 1 молекулы гема

б) 4 полипептидных цепей -1,-2,-1, -2, соединенного с 4 молекулами гема

в) 1 полипептидной цепи, соединенной с одной молекулой гема

г) 2 полипептидных цепей, соединеных с 2 молекулами гема

д) 2 полипептидных цепей, соединенных с 1 молекулой гема

Тест 4

Выберите правильнЫй ответ

Причина серповидной клеточной анемии:

а) нарушение процесса всасывания железа

б) нарушение синтеза гема

в) изменение в результате мутации первичной структуры полипептидной цепи

г) изменена вторичная структура -1, -2, -1, -2 цепей

д) изменена третичная структура -1, -2, -1, -2

Тест 5