Количественное определение в крови метгемоглобина (метод л.Э.Горна).

Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения метгемоглобина в крови.

Мотивация: метгемоглобин образуется в результате реакции окисления железа в геме гемоглобина

HbFe⁺²  e ^ MetHbFe⁺³, т.е. MetHb образование идет под действием любых веществ с дефицитом e^. Этому способствует изменение конформации белковой части молекулы гемоглобина вследствие окисления ряда функциональных групп белка. В крови здорового человека содержание метгемоглобина не более 3%,что достигается равновесием между реакциями его образования и реакциями восстановления метгемоглобина. Из реакций восстановления наиболее значимыми являются следующие:

причем, НАДФН+Н⁺ образуется в ключевых реакциях ПФЦ

причем, НАДН+Н⁺ образуется в ключевых реакциях гликолиза.

причем, данная реакция является неферментативной. Если содержание метгемоглобина в крови превышает 3%- это называется метгемоглобинемия. Метгемоглобинемии делятся на врожденные и приобретенные. Врожденная метгемоглобинемия имеет место при энзимопатиях и гемобинозах. Энзимопатии – генетически обусловленные нарушения синтеза ключевых ферментов, участвующих в восстановлении МеtHb или ключевых ферментов ПФЦ, генерирующих восстановленный НАДФН. Гемоглобинозы делятся на гемоглобинопатии – генетически обусловленные нарушения строения белковой части Hb, возникающие в результате точечных мутаций, и талассемии – состояния развивающиеся в результате генетически обусловленного снижения синтеза какой либо из цепей Hb.

Приобретенные метгемоглобинемии делятся в зависимости от причины на эндогенные и экзогенные. Эндогенная метгемоглобинемия может возникать при различных патологических состояниях или заболеваниях, которые сопровождаются недостаточностью АОС (например: хронический энтерит, хронический гепатит, сахарный диабет и другие).

Экзогенная метгемоглобинемия возникает в случае избыточного поступления в организм человека окислителей, в том числе и лекарственных препаратов со свойствами окислителей. Так как MetHb теряет способность транспортировать О₂, метгемоглобинемия сопровождается признаками гемической гипоксии, которые обусловлены различными нарушениями в обмене веществ. Для профилактики и лечения осложнений необходимо контролировать уровень MetHb в крови.

Быстрым, нетрудоемким методом определения % содержания MetHb в крови является фотоколориметрический метод Л.Э.Горна. Этот метод удобен как для профилактического обследования людей, контактирующих с MetHb образователями, так и в гигиенических исследованиях при производственных и пищевых отравлениях некоторыми химическими соединениями (нитриты,

оксиды азота, пары нитробензола, нитроанилин, гексацианоферрат калия, хлорат калия и др.), при проведении токсикологических исследований на животных.

Принцип метода: метод основан на определении оптической плотности раствора, содержащего метгемоглобин. Метгемоглобин избирательно погло-щает свет с длиной волны 619 нм. Содержание метгемоглобина рассчитывают в процентах, принимая за 100% оптическую плотность раствора полностью окисленного (гексацианоферратом) гемоглобина. Эритроциты разрушают в аммиачной среде.

Ход работы:

В три пробирки отмеривают по 7,3 мл 0,25% раствора аммиака. В две пробирки вносят по 0,2 мл крови, взятой у крысы до затравки. Первая пробирка содержит HbO₂ (100%). Во вторую пробирку добавляют 1 каплю насыщенного раствора K₃Fe(CN)₆, принимая ее за эталон со 100% содержанием MetHb. В третью пробирку отмеривают 0,2 мл крови крысы, отравленной нитритом натрия или другими метгемоглобинообразователями, и определяют в этой крови MetHb.

Пробы оставляют стоять в течение одного часа при комнатной температу-ре, затем растворы фотометрируют, определяя их оптическую плотность. Условия колориметрии: светофильтр красный (длина волны 610 нм), кювета - 10 мм, сравнение против воды.

Для расчета процентного содержания метгемоглобина в исследуемой пробе используют формулу:

Х% MetHb = (D MetHb оп – D HbO₂)  100

D MetHb 100% – D HbO₂

DHbO₂ – оптическая плотность раствора, не содержащего метгемоглобин (кровь, взятая до затравки крысы);

DMetHb100%. – оптическая плотность раствора, содержащего метгемо-глобин в максимальной концентрации;

DMetHbоп – оптическая плотность раствора, содержащего метгемоглобин в неизвестной концентрации (кровь крысы, затравленной нитритом).