Методы определения индукции гамма-интерферона антигенами микобактерий туберкулеза

В последние годы были разработаны, и во многих странах разрешены к применению два варианта лабораторных теста для диагностики латентной туберкулёзной инфекции, основанные на измерении продукции IFN-γ Т-лимфоцитами крови пациента в ответ на стимуляцию белками ESAT-6 и CFP-10. Один из них квантифероновый тест (QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) Cellestis, Victoria, Australia) использует твердофазный иммуносорбентный анализ для измерения антигенспецифичной продукцииIFN-γ циркулирующими клетками цельной крови (рис. 6) . Тест выполняется в течение нескольких часов.QFTобладает высокой чувствительностью и специфичностью. Он позволяет с достоверностью 95% исключить наличие активной туберкулезной инфекции.

Принцип метода состоит в том, что сенсибилизированные лимфоциты человека, инфицированного МБТ или больного туберкулезом, в условиях in vitro(в пробирке) при контакте со специфическими антигенами (в течение 20-24 часов) продуцируютIFN-γ, количество которого измеряется методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Рис. 6. Набор QuantiFERON-TBGoldIn-Tubи анализатор ИФА

Чтобы избежать ошибок, параллельно ставиться проба с неспецифическим митогеном (фитогемагглютинин, неспецифический стимулятор Т-клеток), обязательная для каждого образца. Это дает дополнительную гарантию в случае, если есть сомнения в иммунном статусе пациента. Пробирка с митогеном также служит контролем правильности проведения процедуры, включая взятие и подготовку образца крови, выполнения инкубации (положительный контроль). На исследование берется 3 мл венозной крови (в 3 специально подготовленные пробирки по 1 мл). В одной из пробирок содержаться антигены МБТ – белки ESAT-6 и CFP-10, вторая не содержит антигенов (отрицательный контроль), третья митоген. Поскольку ESAT-6 и CFP-10 экспрессируются при размножении МБТ, иммунный ответ на эти антигены соответствует наличию в организме активной туберкулезной инфекции.

Положительный результат QFT означает текущую инфекцию, вызванную МБТ. При этом данный результат не позволяет дифференцировать недавно приобретенную инфекцию от старой или латентную туберкулезную инфекцию от активного туберкулеза.

Отрицательный результат QFTозначает то, что инфекция, вызванная МБТ маловероятна, но при этом ее нельзя исключить при иммунной супрессии.

Неопределенный результат QFTотмечается при отсутствии отклика клеток на стимуляцию митогеном. Это указывает в первую очередь на погрешности в подготовке образца, либо на то, что у данного пациента иммунная система не функционирует должным образом. Обычно у них отмечается отрицательная проба Манту и в этом случае нельзя подтвердить или отвергнуть туберкулезную инфекцию.

Недостатками квантиферонового теста являются высокая стоимость (24 евро только стоимость расходных материалов на одно исследование), потребность в оснащении лаборатории, обученном персонале, требование к обработке крови для поддерживания функциональной активности лимфоцитов, необходимость взятия крови из вены.

В 2011 г. в России разработана и зарегистрирована новая тест-система - набор реагентов для иммунологического определения туберкулезного инфицирования по индукции интерферона-гамма in virtroв присутствии специфических антигенов микобактерий туберкулёза«Тубинферон».Методика отличается отQFTтем, что наряду со специфическими рекомбинатными антигенами в качестве антигенного индуктора IFN-γ используется туберкулинPPD, повышая качество диагностики туберкулезной инфекции при дифференциальной диагностики инфекционной и поствакцинной аллергии. Чувствительность и специфичность отечественной системы довольно высока 96% и 98% соответственно.

Метод, аналогично, как при QFT, основан на иммуноферментном анализе, где после культивирования образцов гепаринизированной крови пациента при 37°Cв течение 22-24 часов в 3-х пробирках по 1 мл (оконтроль, проба с туберкулиномPPDи проба со специфическими пептидами МБТ ESAT-6 и CFP-10), определяют концентрацию IFN-γ. Наличие туберкулезного инфицирования диагностируют при уровне индукции IFN-γ в пробе со специфическими белками МБТ выше 70 пг/мл (нижний пороговый критерий). При более низких концентрациях в данной пробе и при наличии высокого уровня IFN-γ лишь в пробирки с туберкулином определяется наличие поствакцинной аллергии. Таким образом, по сравнению с квантифероновым тестом проба «Тубинферон» позволяет определить наличие поствакцинной аллергии.

Общий анализ крови. Основными причинами изменений состава крови при туберкулезе являются интоксикация и гипоксия. В начальный период заболевания в крови содержится нормальное количество эритроцитов и гемоглобина. По мере усиления изменений в легочной ткани нарушается газообмен, в результате чего может развиться гиперхромная анемия (увеличение количества гемоглобина при уменьшении количества эритроцитов). При значительном снижении массы тела больного могу наблюдаться явления гипохромной анемии, которая характеризуется уменьшением количества эритроцитов и гемоглобина. Частым спутником туберкулезного процесса является небольшой лейкоцитоз (в пределах 9,0-15,0х10⁹/л). Число лейкоцитов выше 15,0х10⁹/л бывает при казеозной пневмонии и в случае присоединения неспецифического воспалительного процесса. Одновременно увеличивается процент палочкоядерных нейтрофилов (в пределах 6-14%), могут наблюдаться эозинофилия, моноцитоз. При этом количество эозинофильных гранулоцитов может увеличиваться у некоторых больных в период антибактериальной терапии. Тяжелые формы туберкулеза протекают с эозино- и лимфопенией. Лимфопения присуща казеозным формам бронхоаденита, казеозной пневмонии, милиарному туберкулезу. Увеличение СОЭ при ограниченном туберкулезе, чаще бывает в пределах 25-35 мм/час, при казеозной пневмонии, хроническом диссеминированном, фиброзно-кавернозном туберкулезе легких и амилоидозе внутренних органов – до 50-60 мм/час.

Общий анализ мочи. Изменения в моче при туберкулезе легких могут наблюдаться как в начальный период, так и при длительной хронической интоксикации. При неосложненном туберкулезе легких анализы мочи без патологических изменений. У больных с выраженным интоксикационным синдромом на фоне возможны альбуминурия, эритроцитурия, реже цилиндрурия. На фоне лечения эти изменения быстро проходят. Хронические формы туберкулеза осложняются амилоидозом почек. При этом в моче обнаруживают постепенно нарастающую протеинурию, а затем гипостенурию, цилиндрурию. По мере прогрессирования процесса нарушается выделительная функция почек, появляются олигурия, азотемия. Изменения в моче могут быть не замеченными при ранних стадиях амилоидоза, и тогда повышенная СОЭ трактуется ошибочно.