5.7. Выделение продуктов биосинтеза

Общая схема этой стадии технологического процесса представлена на рис. 12. Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной сре­ды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Для отделения биомассы клеток или культуралъной жидкости ис­пользуют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, ваку­ум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культивирования, типа кле­ток, свойств культуральной жидкости.

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавлива­ют и клетки собирают. Неудобство этого способа - необходимость ос­тановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов в окружающую среду, невозможность полного удаления клеток из среды.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды — фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляет­ся за счет накопления клеток на поверхности фильтра. Увеличение дав­ления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки заби­вают поры, образуя менее проницаемый слой.

Разрушение (дезинтеграция) клеток. Для этой цели применяют разнообразные химические, биологические, физические методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка (изменения структуры конечного продукта).

Клеточные стенки микроорганизмов состоят из разных полимеров, поэтому универсального метода их разрушения не существует.

У грамположителъных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N-ацетилглюкозамина и остатков N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками.

У грамотрицателъных бактерий клеточная стенка тоньше и покры­та снаружи слоем липидов.

Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и Р-глюканов.

Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из а- и Р-глюканов, гликопротеидов и хитина.

Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культиви­рования, скорости роста клеток, фазы, на которой они собираются, ус­ловий хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген.

Химический метод разрушения клеточных стенок - обработка ще­лочью. Если белковый продукт не разрушается при рН от 10,5 до 12,5, то можно без труда лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень про­сто выделить из клеток Е. соli обработкой натрия гидрокарбонатом при рН 11. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов.

Основной биохимический метод разрушения клеток микроорганиз­мов - лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для раз­рушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, [B-1,3- и B-1,6-глюканазой, хитиназой - или комплексным дрожжелитическим препа­ратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происхо­дит в мягких условиях.

Клетки можно разрушать физическими методами: немеханически­ми (осмотическим шоком или быстрым многократным замораживани­ем-оттаиванием), механическими (обработкой УЗ, соударением, гомо­генизацией под давлением). Механическое разрушение высокоэффек­тивно, особенно УЗ-излучателями, генерирующими высокочастотные звуковые волны. УЗ-дезинтеграторы состоят из транзисторного генера­тора УЗ-волн, пьезоэлектрического или магнитострикционного преоб­разователя, набора рабочих камер (аппарат на основе УЗ-диспергатора

УЗДН-1, Россия).

При большом количестве клеток используют баллистическую де­зинтеграцию, ее проводят в высокоскоростных шаровых мельницах, куда помещают концентрированную суспензию клеток. Камера мель­ницы заполнена инертным абразивным материалом (стеклянными, по­лимерными шариками диаметром 1 мм). Содержимое быстро переме­шивают лопасти, насаженные на ось. Большинство клеток разрушаются под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате бы­строго движения шариков относительно друг друга, поверхности лопа­стей и камеры. Условия оптимального разрушения клеток подбирают, варьируя числом и формой лопастей, скоростью перемешивания, чис­лом и размером шариков, геометрией камеры, температурой, концен­трацией клеток (аппараты фирмы «Willi A.. Васhhоtеm», Швейцария,(

Gifford Wood Со», США).

Соударение - клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность, в месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Актив­ность клеточных белков при разрушении клеток методом соударения уменьшается незначительно.

Экструзионные методы (продавливание суспензии клеток через капиллярные отверстия) предназначены для обработки жидких или за­мороженных суспензий клеток. Диаметр отверстий рабочих матриц со­ставляет от нескольких миллиметров до десятых его долей. В гидроэкс-трудерах давление достигает 2000-4000 кг/см², в твердофазовых экс-трудерах - 10000-50000 кг/см². После экструзии давление резко сбра­сывают, что вызывает лизис клеток. Экструзионные дезинтеграторы производят фирмы «Маnton Gaulin» (США), LКВ (Швеция).

Дальнейшая обработка. После разрушения клеток их осколки уда­ляют низкоскоростным центрифугированием или микрофильтрацией через мембрану.

Белковый продукт выделяют из лизата методом высаливания — оса­ждением высококонцентрированными растворами нейтральных солей, чаще всего натрия- или аммония сульфатом. Седиментация белка может быть достигнута органическими растворителями (этанолом, ацетоном).