10.3. Методы культивирования изолированных клеток и тканей Твердофазный способ культивирования. Каллусные культуры

При этом способе культивирования используются так называемые твердые питательные среды, содержащие гелеобразующий компонент, чаще всего агар-агар как наиболее близкий по природе субстрат расти­тельного происхождения. Такая среда имеет вид плотного геля, и кал­лусные клетки находятся на ее поверхности.

Для получения каллусных культур небольшие фрагменты тканей разных органов высших растений помещают на поверхность питатель­ной среды (пробирки, колбы). Через 4-6 недель культивирования экспланта образуется первичный каллус (масса недифференцированных клеток), который необходимо разделить и перенести на свежую пита­тельную среду. Каллусная ткань, выросшая на твердой питательной среде, имеет рыхлую аморфную структуру в виде массы тонкостенных клеток белого или желтоватого цвета. Качественный химический состав каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответствующе­го интактного растения.

Твердофазный способ культивирования чаще используется в лабо­раторных условиях для первичного получения изолированных расти­тельных культур, предварительной оценки культур в качестве возмож­ных продуцентов БАВ, а также для выращивания посевного материала. За 4-6 недель среда истощается, что определяет необходимость произ­водить пересев. В противном случае ткани могут погибнуть.

Высшие растения состоят из множества дифференцированных кле­ток с различными функциями: клетки зеленой ткани листа создают ор­ганические вещества в результате фотосинтеза, клетки корня поглоща­ют из почвы минеральные вещества и подают их в другие части расте­ния и т.д. Но все дифференцированные клетки образовались от одной оплодотворенной яйцеклетки материнского растения - зиготы. Эта клетка содержит в себе всю генетическую основу целого растения. Из нее образуются специализированные ткани, различные по химизму происходящих в них процессов, форме и структуре. Клетка (зигота) яв­ляется родоначальником целого растения, она тотипотентна, т.е. мно­гофункциональна. Кроме зиготы тотипотентность в природных услови­ях могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому - веге­тативное размножение черенками, от листа и др. Тотипотентность реа­лизуется также при травмах растений. На раневой поверхности в ре­зультате неорганизованной пролиферации клеток происходит образова­ние нароста - каллуса, способствующего заживлению ран (от лат. callus - мозоль, толстая кожа).

При образовании каллуса в культуре in vitro происходит неоргани­зованный рост клеток и их дедифференциация, т.е. потеря первоначаль­ных функций, свойственных ткани или органу, из которых был получен каллус. Клетки как бы обезличиваются, их функции практически оди­наковы и существуют за счет питательной среды. Однако при измене­нии условий культивирования можно вызвать вторичную дифферен­циацию и получить целое растение. По сравнению с клетками живот­ных и человека растительные клетки обладают большим преимущест­вом. Они способны в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целое растение. Решающую роль во вторичном образовании органов (корней и почек) из изолированных клеток и тканей играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цито-кининов) и их концентрация в питательной среде.

Как бы долго ни выращивались клетки в изолированной культуре, они твердо «помнят» свое происхождение: клетки моркови образуют зародыш целого растения моркови, клетки катарантуса розового — так­же соответствующее растение и т.д. Культивируемые клетки высших растений - это уникальная клеточная популяция, в которой каждая клетка представляет собой отдельный организм, способный к автоном­ному развитию. При регулярном пассировании способность клеток к делению и росту может поддерживаться очень долго. Есть ткани, кото­рые поддерживаются в культуре in vitro no 60-70 лет.

Глубинное суспензионное культивирование

Для посева в жидкую питательную среду необходимо получить по­севной материал в виде суспензии клеток. Поэтому первичная каллус-ная ткань, которая используется в качестве посевного материала, долж­на быть более рыхлой и легко фрагментироваться на отдельные клетки. Для отделения крупных агрегатов клеточную массу перед пересевом фильтруют через нейлоновые или металлические сита. При пересевах на 100 мл среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани.

В лабораторных условиях для культивирования тканей в жидких питательных средах обычно используют колбы емкостью 100-500 мл с небольшим объемом питательной среды. Сосуды с суспензией клеток помещают на качалки с частотой вращения 100—120 об/мин. В таких условиях обеспечивается аэрация тканей и нарастающая масса клеточ­ных агрегатов распадается на отдельные фрагменты.

Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размно­жаются значительно медленнее, чем клетки животных или микроорга­низмов, время их удвоения составляет 1—3 суток. Поэтому даже при суспензионном культивировании стационарная фаза роста клеток, при которой культура достигает максимума сухой биомассы, наблюдается обычно через 2-3 недели. Истощение питательной среды и накопление продуктов жизнедеятельности клеток определяют необходимость об­новления культуральной среды или пересева культуры на свежую пита­тельную среду.

В промышленных условиях используется метод непрерывного куль­тивирования в ферментерах (биореакторах) различной конструкции,имеющих конструктивные особенности, которые учитывают специфику растительных клеток. Метод основан на поддержании баланса между разбавлением.среды и удалением части суспензии.

Если в культуральную систему периодически добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой для создания систем, позволяющих осуществ­лять непрерывное культивирование.

Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделя­ют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выра­щивания через определенные интервалы времени производится отбор . части суспензии и разбавление оставшейся части суспензии свежей сре­дой. Культивирование в ферментерах такого типа может продолжаться несколько месяцев.

Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непре­рывное снабжение культуральной системы свежей питательной средой с одновременным удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры могут функциониро­вать в течение нескольких лет.

Глубинное культивирование в ферментерах имеет ряд преимуществ по сравнению с твердофазным статическим способом:

-автоматически поддерживаются все необходимые параметры: температура, рН среды, степень аэрации, скорость работы ме­шалки и пр.;

-постоянный контроль содержания в культуральной среде ос­новных элементов питания;

-культуральная система периодически пополняется свежей пита­тельной средой;

-постоянно осуществляется микробиологический контроль с це­лью предотвращения инфицирования и гибели культур;

- контроль активности роста и деления клеток;

- контроль образования БАВ.

Необходимо отметить, что для получения БАВ может использовать­ся не только биомасса клеток, но и культуральная среда. В некоторых случаях получаются штаммы и клеточные линии, почти полностью вы­деляющие БАВ в культуральную среду, что значительно облегчает про­цесс их выделения из такого специфического вида сырья.

Культура протопластов

Протопласт - это клетка, лишенная оболочки. Такая «голая» клетка потенциально способна восстанавливать новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить клеточ­ную культуру с новыми свойствами, а затем новое растение - регене-рант. Отсутствие клеточной стенки облегчает проведение различных генетических манипуляций, связанных с реконструированием генома, а также дает возможность получать популяции гибридных клеток в ре­зультате слияния протопластов.

Существует два способа разрушения клеточной оболочки - механи-. ческий и ферментативный. Последний менее травматичен для клеток и чаще используется.

Для получения протопластов растительный материал (например, суспензия клеток мезофилла листа или суспензия культуры изолиро­ванных клеток) обрабатывается препаратами пектиназ и целлюлаз или более сложными смесями ферментов. Для получения суспензии клеток целого растения предпочтительнее использовать листья стерильных растений, культивируемых in vitro, поскольку при получении «голых» протопластов также необходимо соблюдать стерильность.

После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов очи­щают от остатков клеток и тканей фильтрованием, смесь ферментов удаляют центрифугированием с последующим промыванием в культу-ральной среде. После очистки протопласты ресуспендируют в пита­тельной (культуральной) среде. Изолированные протопласты широко используются в качестве модельных систем в физиологических, цито­логических, фитопатологических и других экспериментах, а также ген­но-инженерных манипуляциях.

В настоящее время разработаны способы получения новых гибри­дов в результате слияния изолированных протопластов различных рас­тений. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный за­ряд, то для их соединения необходимо его нейтрализовать. Для индук­ции слияния протопласты обрабатывают полиэтиленгликолем. Частота слияния протопластов может быть увеличена добавлением декстрана, поливинола или под влиянием электрического поля. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться. При слиянии протопла­стов разных родительских растений образуются новые клетки, из которых через культуру каллуса можно регенерировать новое растение с заданными свойствами.

В результате слияния протопластов возникают два вида новых

клеток:

-гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного ро­дителя;

-гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих

родителей.

Больший интерес представляют гетерокарионы, которые после слияния отбирают микроскопически. Для отбора исходные протопласты окрашивают флуоресцентными красителями различных цветов. Если происходит слияние протопластов мезофилла листа (зеленые) и культу­ры изолированных клеток (бесцветные), то получаются гетерокарионы, состоящие из бесхлорофилльных и хлорофиллосодержащих зон, что позволяет вести отбор без предварительного окрашивания.

В результате объединения растительных геномов (ядер и цитоплаз­мы) формируются новые комбинации генов, которые практически не­возможно получить обычными методами селекции. Метод позволяет скрещивать представителей разных видов и родов растений и широко используется при выведении новых сортов пищевых, декоративных, технических, а также лекарственных растений.

Слиянием протопластов получен гибрид томата и картофеля - «то-мофель», гибриды некоторых лекарственных растений: дурмана индей­ского и белладонны, скополии гималайской и белладонны, гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше тропановых алкалоидов, чем родительское растение.

Микроклональное размножение (культура органов растений)

Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных рас­тений, нашли широкое применение в растениеводстве. Этот метод, на­званный микроклональным размножением, позволяет от одной мери­стемы получить (регенерировать) достаточно большое количество но­вых растений, в том числе и в культуре in vitro.

Обязательным условием для микроклонального размножения явля­ется идентичность полученного растительного материала исходному материнскому растению. Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого материала в качестве исходного экспланта используют молодые слабодифференцированные ткани, в частности кончики молодых стеблей и корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков и другие меристематические ткани. Культуры кле­ток, полученные из меристематических тканей, дают возможность по­лучить безвирусные клоны. Распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема, как правило, их лишена.

Восстановление целого растения с помощью изолированных куль­тур может происходить разными путями.

Прямая регенерация - это получение растений «в пробирке» непо­средственно из верхушечных побегов, пазушных почек и т.д.

Косвенная регенерация - получение целых растений из меристема­тических тканей, но с промежуточной стадией каллуса. В обоих случаях дифференциация и органогенез управляется фитогормонами. Выросшее в пробирке растение переносится в грунт.

Следует подчеркнуть, что такой своеобразный способ вегетативного размножения основан на свойстве тотипотентности растительных кле­ток. Это по сути - клонирование растений. В отличие от клонирования животных, которое очень активно обсуждается лишь последнее десяти­летие, метод микроклонального размножения растений используется уже более 40 лет. Впервые этот метод успешно применил французский исследователь Ж. Морель в 1960 г. для размножения орхидеи. Из одно­го безвирусного экспланта ему удалось в течение года получить около 4 млн новых растений, свободных от вирусной инфекции. Метод кло-нального микроразмножения может использоваться для создания элит­ного и суперэлитного посадочного материала.

Основное преимущество метода микроклонального размножения, по сравнению с другими классическими методами, - значительно более высокий коэффициент размножения. Если обычным способом (черен­ками, луковицами, корневищами и т.д.) от одного растения можно по­лучить от 2—3 до 100 растений в год, то методом микроклонального размножения их число можно увеличить от нескольких тысяч до мил­лиона.

К настоящему времени показана возможность клонировать «в про­бирке» около тысячи видов растений. Более чем у ста видов этот метод имеет коммерческое значение. Среди них - декоративные, плодово-ягодные, овощные, древесные, а также некоторые лекарственные рас­тения.

Метод культуры тканей и клеток успешно используется для выве­дения новых сортов, в том числе и высокопродуктивных лекарственных растений. Для создания нового сорта классическим способом в грунте требовалось 10—30 лет. Благодаря методу культуры тканей этот период можно сократить до нескольких месяцев, поскольку сезонность значе­ния не имеет.