6.1. Моиоклональные антитела как лекарственные средства

Молекула антитела (иммуноглобулина) состоит из двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые соединены водо­родными связями и дисульфидными мостиками, расположенными в строго определенных местах. N-концевые участки L и Н-цепей обра­зуют антигенсвязывающий сайт, отдельные области (домены) молекулы антитела выполняют разные функции. Антигенсвязывающие сайты состоят из трех участков, определяющих комплементарность антител к антигену (СDR.) и образующих вариабельные области (V_н и V1) на N-концах Н- и L-цепей. Кроме вариабельных (Vн и V1) каждая L-цепь содержит одну константную область или домен (СО, каждая Н-цепь -три константных области или домена (С_Н1 С_Н2, С_Н3)- При обработке антитела протеолитическим ферментом - папаином —образуются три фрагмента: два идентичных (Fab), каждый из которых содержит интактную L-цепь, связанную дисульфидным мостиком с V_н и С_н1 - до-менами Н-цепи, и один Fc, состоящий из двух соединенной дисульфид-ной связью с Сн2 и Снз - доменов Н-цепи.

Fab-фрагмент, точнее его N-концевая часть, называемая Fv-фраг-ментом, обладает антигенсвязывающей активностью, присущей ин- . тактной молекуле антитела.

После связывания антигена с интактным антителом запускаются ре­акции иммунного ответа:

1.Активируется система комплемента; компоненты этой системы разрушают клеточные мембраны, активируют фагоциты и гене­рируют сигналы, мобилизующие другие компоненты системы иммунного ответа.

2.В результате связывания Fc-участка антитела с Fс-рецептором эффекторной клетки, запускается реакция опосредованной ан­тителами клеточной цитотоксичности. Активированная эффек-торная клетка высвобождает вещества, лизирующие чужерод­ную клетку, с которой связан РаЬ-участок молекулы антитела.

3.После связывания РаЬ-участка с растворимым антигеном, Рс-участок антитела может присоединиться к рецепторам фагоци­тов, которые захватывают и разрушают комплекс антиген - ан­титело.

Для облегчения доставки лекарственного вещества (ЛВ) к месту его действия используют несколько приемов:

• Заключают в липосомы, липидная оболочка которых имеет высо­кое сродство к клеткам нужных органов.

•Встраивают гены специфических токсинов в инфильтрующие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непо­средственно в опухоли.

• Присоединяют молекулы ЛВ к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, специфичным по отношению к белкам, нахо­дящимся на поверхности строго определенных клеток, например опухолевых (рис. 13, A).

• Используют ЛВ в неактивной форме, переводя их в активное со­стояние при помощи ферментов. Чтобы такое превращение про­исходило только вблизи клетки-мишени, фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфичному к поверхностному антигену этой клетки (рис. 13, Б).

В обоих случаях моноклональное антитело связывается с одним специфическим белком на поверхности клетки-мишени.

6.2. Тромболитики и антикоагулянты

Система свертывания крови состоит из тромбоцитов и содержащих­ся в них пластиночных факторов (аденозиндифосфата), тканевого тром-бопластина, серотонина, антиплазмина, фибронектина, тромбоспондина и др.), плазменных белков, синтезирующихся в клетках печени (про­тромбина, проконвертина, антигемофильных глобулинов, тромботро-пина, фибриногена и др.).

Антисвертывающая система представлена плазмином (фибриноли-зином) - протеолитическим ферментом, находящимся в крови в неак­тивном состоянии (плазминоген), белками плазмы крови (протеинами С, 8, антитромбином III, тормозящими процесс образования фибрина, а также веществами, продуцируемыми (простациклин, тромбомодулин и др.) или фиксированными на эндотелиальных клетках (гепарин). При нарушении равновесия между этими двумя системами может возникать или повышенная кровоточивость, или тромбообразование, или сочета­ние того и другого.

Наиболее частой причиной смерти являются тромбоэмболия мозго­вых или сердечных артерий. Известно, что тромб состоит из молекул фибрина, фактора свертывающей системы крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются ферментом, способствующим растворению фибрина in vivo, - сериновой протеиназы плазмина, кото­рый образуется из плазминогена под действием активатора (рис. 14).

Рис. 14. Активация плазминогена с превращением его в плазмин и раз­рушение плазмином двух субстратов (фибриногена и фибрина) в крови

Нередко эта биологическая система работает недостаточно эффек­тивно, что приводит к закупорке артерий. В таких ситуациях для повы­шения уровня плазмина в крови было предложено использовать актива­тор плазминогена (АПг) в качестве терапевтического средства. Однако плазмин способен разрушать и предшественник фибрина - фибриноген (рис. 15), и если уровень фибриногена в результате терапии с использо-

ванием АПг значительно снизится, могут произойти обширные внут­ренние кровотечения.

К моноклональному антителу, специфичному к фибрину, присоеди­нен АПг. Этот комплекс связывается с фибрином, находящимся в тром­бе, АПг вызывает накопление плазмина вблизи тромба, и плазмин лизи-рует тромб.

Тромболитическая терапия, осуществляемая активаторами плаз-миногена тканевого типа (ТАПг), широко используется при лечении острого инфаркта миокарда, закупорки мозговых и коронарных арте­рий, эмболии легких.

Плазминоген человека представляет собой одноцепочечный глико-протеин м.м. 90000; его содержание в плазме составляет примерно 2 мкмоля/л. Плазминоген обладает способностью превращаться в плаз­мин с помощью природных активаторов плазминогена, находящихся в небольшом количестве в органах и тканях, либо с помощью бактери­альной стрептокиназы. Одно из основных свойств АПг - способность участвовать в процессе фибринолиза. Эти ферменты, представляющие собой естественные тромболитические агенты, имеют огромное значе­ние в борьбе с коронарными и церебральными тромбозами и тромбоза­ми сосудов легких.

Активирование плазминогена стептокиназой заключается в образо­вании на начальной стадии комплекса плазминоген - стрептокиназа, обладающего способностью активировать молекулу плазминогена; этот комплекс затем с помощью ферментативного механизма обеспечивает превращение плазминогена в плазмин.

Плазмин (фибринолизин) является эндопептидазой широкого спек­тра действия. Как плазминоген, так и плазмин содержат по пять ди-сульфидных мостиков, за счет которых формируются специфические домены. Препарат является протеолитическим ферментом, образую­щимся при активации трипсином содержащегося в крови человека плазминогена. Он вызывает только наружный лизис тромба (преимуще­ственно в венах), так как быстро нейтрализуется антиплазмином, в из­бытке циркулирующим в крови.

Плазмин обладает свойствами активатора, переводящего эндоген­ный плазминоген в плазмин. Продукты деградации фибрина, образую­щиеся при его разрушении, препятствуют полимеризации мономеров фибрина и образованию тромбопластина.

Однако плазмин может вызвать активацию свертывающей системы крови и повысить антифибринолитические свойства крови. Поэтому его вводят с гепарином.

Генерируемый активатором плазминогена плазмин кроме растворе­ния тромбов способен стимулировать • деление клеток, видоизменять клеточные поверхности, активировать специфические протеазы, пре­вращать проинсулин и проадренокортикотропин в инсулин и АКТГ со­ответственно.

С учетом м.м., энзиматических и серологических свойств, способ­ности связывать фибрин плазмы крови АПг принято делить на актива­торы тканевого и урокиназного типов.

Активаторы плазминогена тканевого типа. Содержание ТАПг широко варьирует в различных органах тканей: препарат, полученный из ткани матки человека, характеризуется м.м. 690.00 и состоит из двух полипептидных цепей с м.м. 31000 и 38000; фермент, экстрагированный из клеток сосудов трупа человека, имеет м.м. 60000 и состоит из двух близких по размеру полипептидов. Природный ТАПг может существо­вать как в виде протеолитически деградируемой двухцепочечной, так и одноцепочечной формы.

Получают природный ТАПг методом культивирования клеток. Ос­новной источник получения препарата - линия клеток меланомы чело­века; такой фермент - мТАПг характеризуется м.м. 72000 и, в зависи­мости от условий культивирования и очистки, может быть получен в одно- и двухцепочечной форме. Для очистки ТАПг, полученного из культуры клеток меланомы, применяют аффинную хроматографию с использованием пяти аффинных сорбентов: конканавалина А, п-аминобензамидина, имидинодиуксусной кислоты, борной кислоты, ли­зина - все марки 5PW.

Метод получения рекомбинантного ТАПг (рТАПг) разработан в 80-х гг. XX в. Ген ТАПг расположен у человека в хромосоме 8. Тех­нологи клонирования и экспрессии рТАПг в клетках Е. coli, S. cerevisiae и клетках животных позволили получать ТАПг в промышленных мас­штабах, провести широкое клиническое изучение и выйти на мировой рынок тромболитиков.

Сравнительное изучение мТАПг и рТАПг в отношении тромболизи-са при инфаркте миокарда и других типов тромбозов показало полную идентичность их биологических тромболитических свойств. Лидерами в области разработки рТАПг (альтеплазы) являются фирмы «Genentech» и «Boehringer Ingelheim», выпускающие альтеплазу под торговыми на­званиями activase и actilyse.

Активаторы плазминогена урокиназного типа. Урокиназа — ак­тиватор плазминогена, содержащийся в моче человека, состоит из двух полипептидных цепей (А и В), соединенных между собой дисульфид-ным мостиком, встречается в высоко- и низкомолекулярной формах (м.м. соответственно 55000 и 34000).

Препарат получают из культуры клеток эмбриона почки человека. Урокиназа активирует плазминоген, превращая его в плазмин. Фибри-нолитический эффект наступает быстрее, чем от стрептокиназы. Препа­рат способен активировать фибринолиз внутри тромба (эндотромболиз) и на его поверхности (экзотромболизис). По клинико-фармакологичес-кой характеристике урокиназа близка к стрептокиназе. Урокиназа не обладает выраженными антигенными свойствами, поэтому при ее ис­пользовании меньшая опасность возникновения аллергических реакций и ее назначают повторно.

Одноцепочечная форма урокиназы получила название проурокина-зы. Проурокиназа является проферментом урокиназы, содержится в различных органах и тканях, включая плазму крови. Проурокиназа — одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 411 аминокислот. Гидро­лиз одной из пептидных связей плазмином способствует ее трансфор­мации в урокиназу.

Большое значение имеет получение активаторов плазминогена уро­киназного типа методом генной инженерии. Ген урокиназы/проуро-киназы локализуется у человека в хромосоме 10; продукт экспрессии гена урокиназы, клонированного в Е. coli, содержит одну или две цепи в зависимости от присутствия ингибиторов протеаз в процессе очистки фермента. Оценка биологических и фибринолитических свойств реком-бинантной урокиназы (р-урокиназы), рекомбинантной проурокиназы (р-проурокиназы) и природной урокиназы, выделенной из мочи, пока­зала, что рекомбинантные урокиназа и проурокиназа обладают лучшей тромбоселективностью и вызывают меньшее число побочных явлений, чем урокиназа.

Стрептокиназа - тромболитик прямого действия, является актива­тором плазминогена, относится к тромболитикам 1 поколения. В очи­щенном виде стрептокиназа представляет собой пористую массу белого цвета без запаха, легко растворимую в воде, м.м. 40000—50000.

Препарат получают из р-гемолитического стрептококка группы С. Это непрямой фибринолитик. Стрептокиназа стимулирует перевод циркупирующего в крови проактиватора в активатор, трансформирующий плазминоген в плазмин. Препарат способен проникать внутрь тромба и активировать в нем фибринолиз, чем выгодно отличается от плазмина. Продукты распада тромба, циркулирующие в крови, вызывают гипокоагуляцию, блокируют агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, снижают

вязкость крови.

Среди тромболитических препаратов стрептокиназа занимает проч­ную позицию, что обусловлено доступностью получения ее из микроб­ного сырья и относительно невысокой реактогенностью (антитела к стрептокиназе исчезают в течение 6 месяцев; иммунологическая реактогенность этого белка обычно проявляется лишь у лиц с отягощенным анамнезом, например, перенесших стрептококковую инфекцию).

На мировом рынке медикаментов лидируют препараты стрептоки-назы из микробного сырья: кабиказа (фирма «Kabi Vitrum»), стрептаза (фирма «Hoechst»), стрептокиназа (фирма «Smith Kline»).

Фирма «Phillips Petrolium» (США) запатентовала метод экспрессии стрептокиназы в S. cerevisiae. Экспрессируемый в дрожжах белок по м.м. и активности идентичен стрептокиназе, полученной из Streptococ­cus equisimilis. Метод рекомбинантных ДНК позволил получить высо­кий выход искомого продукта - 1г/1л среды.

Методом рекомбинантных ДНК получен вектор, несущий ген стрептокиназы, адаптированный для трансформации в бактериальный геном (патент США).

Запатентован метод (Германия) ферментационного получения стрептокиназы; генноинженерным способом получена плазмида, со­держащая ген стрептокиназы. Экспрессия стрептокиназы получена трансформацией этой плазмиды в клетки Streptococcus. После фермен­тации таких клеток из культуральной жидкости выделена и очищена стрептокиназа м.м. 42000.

Стрептодеказа — пролонгированный препарат стрептокиназы, от­носящийся к группе иммобилизованных ферментов, нанесенных на во­дорастворимую матрицу полисахаридной природы. Однократное введе­ние средней терапевтической дозы обеспечивает повышение фибрино-литической активности крови в течение 48—72 ч.

Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (актилизе) яв­ляется гликопротеином (полным аналогом эндогенного вещества, выра­батываемого эндотелием), который после системного введения нахо­дится в плазме в неактивной форме до момента связывания с фибрином. После активации препарата он способствует переходу плазминогена в плазмин и ведет к растворению фибринового сгустка, повышая фибри-нолиз только в ткани тромба.

Ацилированный комплекс стрептокиназы и плазминогена (тор­говое название эминаза) - тромболитик 2-го поколения, разработан и запатентован английской фирмой «Beecham». Ацильная группа, входя­щая в состав комплекса, защищает тромболитик от инактивации при­родным ингибитором L₂-антиплазмином. По мере поступления eminase в кровяное русло начинается быстрое гидролитическое отщепление ацильной группы, высвобождение активированного комплекса проис­ходит с постоянной скоростью. Комплекс действует почти исключи­тельно на фибрин кровяного сгустка, не затрагивая фибриноген. Наибо­лее грозное побочное действие тромболитиков — возникновение внезап­ных кровотечений - проявляется при применении eminase весьма редко. Успех международных клинических испытаний eminase обеспечил при­знание этого тромболитического средства на мировом рынке.

В качестве тромболитиков предложены химерные (гибридные) мо­лекулы, содержащие домены ТАПг и урокиназы; эти гибридные моле­кулы характеризуются таким же сродством к фибрину и способностью к лизису тромбов, как и рТАПг. Химерные молекулы получают мето­дом слияния концевой кДНК, кодирующей концевой аминосодержащий фрагмент ТАПг, ответственный за специфичность в отношении фибри­на, с кДНК, кодирующей концевой карбоксисодержащий фрагмент проурониказы, ответственный за ферментативные свойства молекулы. Это соединение обладает специфичностью к фибрину, характерной для обеих молекул; лечебная доза этого препарата может быть в 4 раза меньшей, чем доза ТАПг и урокиназы, вводимых отдельно; прямым следствием снижения дозы является уменьшение вероятности возник­новения побочного действия.

Сконструированы химерные молекулы, содержащие фрагменты ТАПг, урокиназы и проурокиназы, клонированные в животных клетках (фирма «Ciba-Geigy», Швейцария).

Разработаны генно-инженерные системы доставки тромболитиков (США). Описано строение моноклонального антитела, способного дос­тавить тромболитический белок к месту образования тромба. Гены, от­ветственные за образование Р-цепи ТАПг, были внедрены в гибридомы, продуцирующие антитела, которые экспрессировали белок, способный избирательно доставляться к месту скопления фибрина, кроме того, та­кой активированный белок способен активировать плазминоген (фирма «Genentech»).

Антикоагулянты. Гепарин и его производные принадлежат к числу наиболее безопасных препаратов. Гепарин относится к гуморальным факторам регуляции жидкого состояния крови и обладает высокой свя­зующей способностью практически ко всем факторам системы коагуля­ции. Гепарин нейтрализует действие сериновых протеиназ и фибрино-вых систем за счет образования комплекса антитромбин Ш-гепарин (АТ-Ш-гепарин). Препараты гепарина гетерогенны и содержат фракции с высоким и низким средством связывания с АТ-Ш (АТ-Ш является ин­гибитором активаторов плазминогена).

В медицинской практике используются препараты низкомолекуляр­ного или фракционного гепарина — логипарин, фраксипарин, далтепа-рин, кливарин. Их относят к гепаринам II поколения. Получают низко­молекулярные гепарины методом ферментативной деполимеризации высокомолекулярного гепарина с помощью бактериальной гепариназы. Гепарин повышает активность фибринолитической системы за счет об­разования комплекса с антиплазмином. Гепарин накапливается на по­верхности эндотелиальных клеток и клеток крови, создавая на их мем­бранах концентрацию в 100 раз большую, чем в плазме крови. Этим он придает поверхности эндотелия и тромбоцитов отрицательный заряд, препятствуя их адгезии и агрегации, а также высвобождению из них агрегирующих факторов.

Низкомолекулярные гепарины не влияют на коагуляцию, т.е. они не изменяют время свертывания крови, но их терапевтический эффект больше, чем у высокомолекулярных форм. Это свидетельство того, что основное в действии гепарина — ограничение агрегации и адгезии тром­боцитов. Подтверждением данного механизма является и отсутствие корреляции между клинической эффективностью гепарина и увеличе­нием времени свертывания крови.

Антикоагулянт фрагмин (фирма «Kabi Vitrum», Швеция) получают из стандартного гепарина, извлекая из него составную часть, обладаю­щую наибольшей антикоагулянтной активностью. Fragmin имеет доста­точно длительный период полураспада, что позволяет применять его в виде однократной подкожной инъекции. Кроме антикоагулянтного и тромболитического действий отмечено его благоприятное влияние на снижение уровня триглицеридов в крови. ВОЗ рекомендовала исполь­зовать фрагмин в качестве международного стандарта при оценке ле­чебного эффекта и безопасности антикоагулянтов нового поколения.

Методом органического синтеза (фирмы «Organon», Нидерланды и «Choy», Франция) получен гепариноид - аналог гепарина; активное на­чало этого препарата оставляют сульфатированные олигосахариды.

Гирудин - антикоагулянт прямого быстрого действия, это белок, вырабатываемый слюнными железами медицинской пиявки (Hirudo medicinalis), которая в течение ряда лет использовалась для предотвра­щения тромбоэмболии мелких сосудов. Гирудин является сильным и специфичным ингибитором тромбина и относится к группе противо-свертывающих препаратов прямого быстрого действия, препятствую­щих образованию и отложению нитей фибрина. Он инактивирует свя­занный с фибрином тромбин в тромбах. Существует несколько близко­родственных вариантов гирудина (HV1,HV₂, HV₃). Наиболее изучен HV], представляющий белок с м.м. около 7000, состоящий из 65 амино­кислотных остатков. Гирудин ингибирует только тромбин и неактивен в отношении трипсина и плазмина. Введение гирудина не влияет на рабо­ту сердца, органов дыхания, иммунной системы.

В настоящее время гирудин получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Ген герудина экспрессирован в S. cerevisiae (фирмы «Francgene», «Sanofi», Франция); для очистки препарата ис­пользована ВЭЖХ.

Фирмой «Ciba Geigy» разработан метод экспрессии частично де-сульфатированного варианта гирудина (десульфатогирудина) в S. cerevisiae. Рекомбинантный гирудин с одной отсутствующей сульфо-группой по антикоагулянтной активности превосходит гепарин.

Белки С и S являются важными факторами антикоагулянтной сис­темы. Белок С был впервые описан в 1960 г. как аутопротромбин П-а и лишь в 1976 г. выделен в чистом виде. Белок С-гликопротеин м.м. 62000 состоит из двух субъединиц, связанных дисульфидным мос­тиком, содержит около 10 аминокислотных остатков у-карбоксиглюта-миновой кислоты.

Белок С является витамин-К-зависимым ингибитором свертываю­щей системы. Имеются данные, что снижение уровня белка С в крови связано с риском возникновения тромбозов, причем дефицит этого бел­ка бывает наследственным и приобретенным; так, при недостатке белка С может развиться тромбофлебит. Дефицит белка С наблюдается при заболеваниях печени (возможно, синтез белка С происходит в этом ор­гане).

Белок S является кофактором белка С и образует с последним акти­вированный комплекс на поверхности фосфолипидных мембран тромбоцитов, эндотелиальных и других клеток; в результате каталитическая способность белка С возрастает. Белок S также является витамин-К-зависимым и имеет высокое средство к отрицательно заряженным фосфолипидам. Белок S - гликопротеид с м.м. 69000.

Разработана технология получения рекомбинантного белка С (фир­ма «Eli Lilly») в культуре клеток почек, трансформированной аденови­русом. Очищенный белок на 90% представлен двухпептидным компо­нентом и на 10% однопептидным, по активности не уступает белку С, находящемуся в плазме крови человека. Генноинженерный препарат белка С предложен для лечения последствий ортопедической и абдоми­нальный хирургии, легочной эмболии.

Два рекомбинантных гибрида белка С (антикоагулянтной и фибри-нолитической активности) (фирма «Hoechst Japan»), не уступающие белку С из крови человека, предупреждают острый инфаркт миокарда и послеоперационные тромбозы.

В 1982 г. выделен и охарактеризован еще один кофактор активации белка С - тромбомодулин, локализованный в мембране эндотелиальных клеток и являющийся кальций-зависимым ингибитором коагуляции и агглютинации тромбоцитов. Тромбомодулин — неразветвленный глико-протеин с м.м. 68000—77000, содержит 117 аминокислотных остатков. Выделен структурный ген тромбомодулина, ген клонирован с после­дующей экспрессией в клетках почек обезьяны (фирма «Asahi Chemical», Япония).