5.6. Методы контроля биомассы и количества клеток при культивировании. Апоптоз и некроз клеток

Под определением биомасса подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твёрдой или жидкой питательной среде при культивировании. Наиболее чувствительный метод контроля био­массы - подсчёт клеток с определением линейных размеров или числа жизнеспособных клеток (метод окрашивания) при помощи микроскопа. Количество клеток в биомассе можно контролировать и по объёму осаждения в центрифужных стаканчиках. Также используют косвенные методы определения биомассы по интенсивности дыхания (изменению концентрации СО₂ инфракрасным газоанализатором) или содержанию белка (самый чувствительный метод - бромсульфалеиновая проба, ос­нованная на связывании бромсульфалеина основными группами белка). Количество микроорганизмов и клеток можно определять физикохимическими методами: кондуктометрически (по удельной электропро­водимости), спектрофотометрически, колориметрически, нефелометри-чески.

Гибель клеток ведёт к выделению клеточных фрагментов, загряз­няющих фильтры и пробы, высвобождению внутриклеточных фермен­тов.

Гибель клеток идёт по двум механизмам: апоптоз и некроз.

Погибать могут, казалось бы, вполне жизнеспособные клетки, т.е. те, которые еще не успели исчерпать свои жизненные ресурсы. Зачас­тую активную роль в своей гибели играет сама клетка — с помощью со­держащихся в ней механизмов, которые лишь запускаются теми или иными факторами внеклеточной или внутриклеточной среды; в резуль­тате возникло представление об апоптозе или программированной кле­точной гибели. Апоптоз определяют, как программируемую клеточную смерть, понимая под этим такую гибель клетки, в развитии которой ак­тивную роль играют специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы.

Исходный смысл слова «апоптоз» весьма поэтичен, по-гречески он означает опадание листьев.

Круг обстоятельств, когда в клетке включается программа апоптоза, весьма широк, их можно представить двумя группами:

-«неудовлетворительное» состояние самой клетки, что вызывает апоптоз изнутри;

-«негативная» сигнализация снаружи, передающаяся через спе­циальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»).

О «неудовлетворительном» состоянии самой клетки может свиде­тельствовать серьезное повреждение хромосом и внутриклеточных мембран. В этом смысле апоптоз выполняет функцию уничтожения де­фектных клеток. Важнейший инструмент апоптоза - цитоплазматиче-ские протеазы, ядерные эндонуклеазы, последние разрушают ДНК не до нуклеотидов, а лишь до более или менее крупных фрагментов. К про­чим «орудиям» апоптоза относится совокупность сильных окислителей - избыточное накопление не только оксида азота, но и других реакци-онноактивных веществ — супероксидного и гидроксидного радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т.д. Известно, что в нормальной клетке существуют механизмы защиты от радикалов и окислителей. Это ферменты антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза (превраща­ет супероксид в перекись водорода), каталаза и пероксидаза, элимини­рующие из среды пероксид водорода.

Повреждения клеток могут быть вызваны изменением температуры, нарушением питания. Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели становится неуправляемым - это уже некроз.

Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера по­вреждающих воздействий гибель клетки может пойти либо по апопти-ческому, либо по некротическому пути.