10.2. Особенности культивирования изолированных клеток и тканей растений

Изолированные ткани и клетки растений могут успешно расти толь­ко при отсутствии конкуренции с микроорганизмами. Все работы по культивированию растительных объектов необходимо производить в асептических условиях. Если в состав питательной среды входят термо­лабильные вещества, их фильтруют через мембранные стерилизующие фильтры и добавляют в простерилизованную среду, охлажденную до 30-40 °С.

Изолированные фрагменты растения (экспланты), помещаемые на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому их также необходимо стерилизовать. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают несколько раз водой очищенной. Затем растительный материал стерилизуют в растворах де­зинфицирующих веществ, несколько раз промывают водой и стерильным скальпелем удаляют наружные поврежденные слои клеток. Не­большие кусочки эксплантанта помещают на поверхность питательной среды с гелеобразующим компонентом. Клетки изолированных расти­тельных тканей могут делиться и давать начало длительно растущей недифференцированной массе, называемой каллусом.

В настоящее время изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, которые отличаются по сво­ему составу в зависимости от вида культуры. В состав всех питатель­ных сред обязательно входят необходимые растению макроэлементы. Лучшей формой азотного питания являются нитраты (калия или аммо­ния), в некоторых случаях дополнительно используются аминокислоты. Кроме азотистых соединений необходимы фосфор, сера, кальций, суль­фаты. Отсутствие в питательной среде микроэлементов уже в первом пассаже (пересадке) может уменьшить интенсивность роста тканей на 30-40%, а при последующих - гибель тканей. В зависимости от вида изолированной культуры могут в небольших количествах использо­ваться: железо, бор, цинк, марганец, медь, алюминий, никель, йод и др.

Для успешного роста культур необходимы также источники углеро­да, поскольку даже зеленеющие, выращиваемые на свету ткани неауто-трофны. Лучшим источником углеводного питания является сахароза, используемая обычно в концентрации 2-5%. Реже используется глюко­за или другие сахара.

Большинство тканей, культивируемых in vitro, способны к синтезу всех нужных для их жизнедеятельности витаминов, если все питатель­ные элементы присутствуют в средах. Однако большинство культур синтезируют витамины в субминимальных количествах, поэтому до­полнительное внесение витаминов в среду также способствует росту клеток, особенно это относится к витаминам группы В. Чаще исполь­зуют витамины В1 В2, В₆, а также кальция пантотенат, биотин, кислоты: аскорбиновую, никотиновую, фолиевую.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть фи-тогормоны. К ним относятся ауксины, регулирующие рост и дифферен-цировку клеток и цитокинины, индуцирующие клеточное деление. Природный ауксин в растении представлен в основном в виде (3-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Для практических целей чаще применяют не ИУК, а синтетические ауксины (а-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), фенилук-сусная кислота (ФУК), фенилмасляная кислота (ФМК) и др.) В отличие от природных ауксинов эти соединения не разрушаются ИУК-оксида-зой в клетках растений.

В качестве источников цитокининов в средах используют кинетин, зеатин, 6-бензиламинопурин и др. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усиле­нием синтеза ДНК, РНК, белков, а также в дифференцировке клеток. В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная ки­слота) или ее натриевая соль, которые улучшают усвоение клетками железа.

На рост и развитие растительных тканей и клеток in vitro большое влияние оказывают физические факторы: свет, температура, аэрация, влажность воздуха. Большинство изолированных культур выращивают­ся в темноте. При необходимости они могут расти и на свету, образовы­вая хлорофилл, но при этом проявляют низкую способность к фотосин­тезу. В некоторых случаях свет может использоваться как фактор, обес­печивающий морфогенез или активизирующий процесс синтеза биоло­гически активных веществ. Для освещения чаще используют люминес­центные лампы с интенсивностью светового потока 1000-1500 люкс. Оптимальная температура для успешного роста большинства куль­тур составляет 25-27 "С; для индукции их морфогенеза требуются более низкие температуры (18-25 °С). Влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60-70%. Интенсивная аэрация требуется при культивировании клеток в больших объемах с использованием жидких питательных сред. Аэрацию биомассы клеток осуществляют барботированием стерильным воздухом. При выращивании клеток в малых объемах (колбах) аэрация достигается постоянным перемешива­нием суспензий клеток с помощью качалок различной конструкции.