Глава 11. Биодеградация токсических соединений и утилизация биомассы

Еще сравнительно недавно ни у кого не возникало сомнений, что окружающая среда - земля, воздух, вода - всегда будут эффективно перерабатывать бытовые, промышленные, сельскохозяйственные отхо­ды. Человечество столкнулось с двумя фундаментальными проблемами - переработкой отходов, постоянно образующихся в огромном количе­стве, и разрушением токсических соединений, десятилетиями накапли­вающихся в воде, почве, на свалках. Отходы сжигают, обрабатывают химикатами, но это лишь усугубляет загрязнение окружающей среды и, к тому же, дорого обходится. Разные страны пытаются решить эти про­блемы законодательным путем, однако успеха здесь нет. В условиях НТП экосфера испытывает мощное антропогенное воздействие, в ре­зультате нарушается природная гармония, сложившаяся тысячелетиями, происходят заметные сдвиги в экосистемах, приводящие к исчезнове­нию целых видов животных и растений, возникают новые формы мик­роорганизмов, нарушаются иммунные реакции человека.

В настоящее время проходят проверку многие технологические, в том числе биотехнологические приемы, с помощью которых возможно перерабатывать большие количества отходов и токсических веществ. Правительства многих стран поощряют предприятия, перерабатываю­щие отходы производства, повторно использующие содержащиеся в них полезные вещества.

Термин «биодеградация» относится к процессу разрушения загряз­няющих веществ, попавших в окружающую среду, с помощью живых микроорганизмов. Термин «биомасса» - к совокупности веществ и ма­териалов, побочных продуктов пищевой, перерабатывающей промыш­ленности, ранее считавшихся отходами, ставших сырьем для производ­ства ряда экономически важных продуктов.

В середине 1960-х гг. были обнаружены почвенные микроорганиз­мы, способные деградировать ксенобиотики (гербициды, пестициды, хладагенты, органические растворители и т.д.). Основную группу поч­венных микроорганизмов, разрушающую ксенобиотики, составляют бактерии рода Pseudomonas, разные штаммы которых способны расще­плять более 100 органических соединений.

В биодеградации сложной органической молекулы обычно участ­вуют несколько разных ферментов. Гены, кодирующие такие энзимы, могут иметь хромосомную локализацию, но чаще всего входят в состав крупных плазмид, иногда локализуются и в хромосомной, и в плазмид-ной ДНК.

Бактерии, разрушающие негалогенированные ароматические соеди­нения, как правило, превращают их в катехол или протокатехоат. Затем, в ходе нескольких реакций окислительного расщепления, - в ацетил-СоА и сукцинат или пируват и ацетальдегид, последние метаболизиру-ют практически все микроорганизмы.

Галогенированные ароматические соединения, основные компонен­ты большинства пестицидов, гербицидов, с помощью этих же фермен­тов разрушаются до катехола, протокатехоата, гидрохинона или их га-логенированных производных; причем скорость их деградации обратно пропорциональна числу атомов галогена в исходном соединении. Дега-логенирование (отщепление замещенного атома галогена от органиче­ской молекулы) необходимо для детоксикации соединения. Дегалоге-нирование осуществляется по ходу неспецифической диоксигеназной реакции замещением галогена в бензольном кольце на гидроксильную группу.

11.1. Метаболические пути биодеградации ксенобиотиков, созданных методом генной инженерии

Ряд микроорганизмов обладает природной способностью к деграда­ции различных ксенобиотиков, однако:

-ни один из них не может разрушать все органические соеди­нения;

-некоторые органические соединения при высокой концентрации подавляют функционирование или рост микроорганизмов, ихдеградирующих;

-большинство очагов загрязнения содержат смесь химикатов; микроорганизм, способный разрушать один или несколько ком­понентов этих смесей, может инактивироваться другими компо­нентами;

-многие неполярные соединения адсорбируются частицами поч­вы и становятся менее доступными;

-биодеградация органических соединений происходит довольно медленно.

Часть этих проблем решает конъюгированный перенос плазмид в один рецепиентный штамм. Если две плазмиды содержат гомологичные участки, между ними может произойти рекомбинация с образованием гибридной плазмиды, которая имеет больший размер и обладает свой­ствами исходных плазмид. Если две плазмиды не содержат гомологич­ных участков и относятся к разным группам несовместимости, они мо­гут сосуществовать в одной бактерии.

В 1970 г. был создан первый бактериальный штамм, обладающий более широкими катаболическими возможностями. Он расщеплял большинство углеводов нефти и был назван «супербациллой». Для его получения использовали плазмиды, каждая из которых кодировала фермент, расщепляющий определенный класс углеводородов (рис. 22).

Конъюгацией была перенесена плазмида САМ в штамм, несущий плазмиду ОСТ. Эти плазмиды несовместимы (не могут существовать в одной клетке в виде отдельных плазмид), но в результате произошед­шей между ними рекомбинации образовалась одна плазмида, объеди­няющая их функции. Затем плазмиду NAH перенесли в штамм, несу­щий плазмиду XVL; эти плазмиды совместимы и могут сосуществовать в одной клетке-хозяине. Наконец, гибридную плазмиду перенесли в штамм, несущий плазмиды NAH и XVL. В результате этих манипуля­ций получили штамм, растущий на неочищенной нефти лучше исход­ных штаммов, взятых по отдельности или вместе. Этот штамм не ис­пользовали для ликвидации нефтяных загрязнений, но он сыграл важ­ную роль в становлении биотехнологической промышленности. Изо­бретатель «супербациллы» получил патент США, описывающий струк­туру данного штамма и возможности его применения. Это был первый патент на создание генетически модифицированного микроорганизма.

Большинство разрушающих ксенобиотики бактерий, модифициро­ванных переносом плазмид, являются мезофилами. Вода загрязненных рек, озер обычно имеет низкий диапазон температур, поэтому была соз­дана бактерия, обладающая более широкими катаболическими возмож­ностями, способная расти и развиваться при более низких температу­рах. Для этой цели плазмиду TOL (детерминирует разрушение толуола) методом конъюгации перенесли в психрофильный штамм Pseudomonas putida, утилизирующий салицилат при температуре О °С. Трансформи­рованный штамм содержал введенную в него плазмиду TOL и собст­венную плазмиду SAL, детерминирующую при О °С разрушение сали-цилата и толуола как источников углерода. Психрофильный штамм не-трасформированного типа не мог расти при любой температуре, если единственным источником углерода был толуол. Эта работа показала принципиальную возможность создания психрофильных штаммов бак­терий, эффективно разрушающих ксенобиотики в природных условиях.

Объединение разных метаболических путей в одном микроорганиз­ме с помощью конъюгации - это лишь один из способов создания бак­терий с новыми свойствами. Можно расширить их катаболические воз­можности, модифицируя гены, кодирующие ферменты того или иного метаболического пути. Совершенствование того или иного катаболиче-ского пути реально с помощью технологии рекомбинантных ДНК, тра­диционного мутагенеза и соответствующих методов отбора.

Одним из наиболее распространенных веществ, загрязняющих поч­ву и воздух, является трихлорэтилен, широко использующийся в качестве растворителя и обезвоживающего средства. Трихлорэтилен дли­тельное время остается в окружающей среде, считается канцерогенном; к тому же, анаэробные почвенные бактерии дегалогенируют его, пре­вращая в еще более токсичное соединение — винил хлорид.

Некоторые штаммы P. putida, разрушающие такие ароматические соединения, как толуол, разрушают и трихлорэтилен. Генетическими исследованиями установлено, что для полной детоксикации трихлорэ-тилена не нужны все ферменты расщепления ксилола и толуола, доста­точно лишь толуолдиоксигеназы, которая в норме катализирует реак­цию окисления толуола до цис-толуолдигидродиола. Образование функциональной толуолдиоксигеназы кодируется четырьмя генами; их выделили и экспрессировали в Е. coli под контролем сильного промото­ра, который активируется изопропил-B-D-тиогалакто-пиранозидом, в результате трихлорэтилен разлагается до безвредных соединений. Ис­ходная скорость деградации трихлорэтилена в Е. coli ниже, чем Р. putida, но она более длительно сохраняется в Е. coli.