5.5. Повышение эффективности ферментации

Независимо от типа биореактора процесс ферментации строго кон­тролируют по:

-концентрации растворенного кислорода;

- рН;

-температуре;

-интенсивности перемешивания биомассы.

Существенные изменения любого из этих параметров резко снижа­ют скорость роста клеток и стабильность белкового продукта. Для оп­тимального роста Е. соli и других микроорганизмов, используемых при экспрессии рекомбинантных белков, нужна хорошо аэрируемая культуральная среда. Кислород плохо растворим в воде (0,0084 г/л при 25 °С), поэтому он должен подаваться в среду непрерывно. В процессе фер­ментации специальный датчик контролирует содержание растворенного кислорода в среде, равномерность его распределения по всему объему, тщательность перемешивания культуры, что, вместе взятое, обеспечи-

вает эффективность диспергирования пузырьков. Пространство, где взаимодействуют микроорганизмы и питательная среда, принято назы­вать микросредой. Если микросреда данной культуры одинакова в каж­дой точке, такую культуру считают гомогенной. Гомогенность достига­ется эффективным перемешиванием всех компонентов среды и микро­организмов по всему рабочему объему. Гомогенность невозможна без аэрации, которая осуществляется барботерами различных конструкций, например, в виде кольцевого желоба с отверстиями, перфорированной трубы или форсунки.

Оптимальный рост большинства микроорганизмов идет при рН от 5,5 до 8,5; однако клеточные метаболиты, выделяющиеся в культураль-ную среду, могут изменять рН. Изменение рН среды заметно сказывает­ся на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточ­ных продуктов, их диссоциации, растворимости и т.п., что значительно влияет на выход конечного продукта. Тщательно контролируя рН, при необходимости в ферментер добавляют кислоту или основание, хорошо перемешанные с питательной средой и равномерно распределенные по всему объему.

Успех ферментации зависит от температуры. Если она ниже опти­мальной (37 °С), рост микроорганизмов замедлен, интенсивность их метаболизма снижена. При повышении температуры до 38 °С, возмож­на преждевременная индукция синтеза белка или индукция белков теп­лового шока, что активирует клеточные протеиназы и снижает выход белкового продукта. Для отвода тепла используют охлаждающую ру­башку. Тщательное перемешивание культуральной среды - один из наиболее распространенных процессов в БТ. Перемешивание необхо­димо для:

-равномерной доставки питательных веществ к клеткам;

- предотвращения накопления токсических побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом участке биореактора.

Механическое перемешивание и аэрация снабжают растущую куль­туру кислородом, азотом, отводят продукты газообмена и физиологиче­ское тепло, выделяемое микроорганизмами в процессе биосинтеза, спо­собствуют гомогенизации суспензии, увеличивают скорость процессов масса- и теплообмена.

Конструкция мешалки играет важную роль в работе биореактора. Мешалки делят на быстро- и тихоходные. Быстроходные аппараты с большой и средней циркуляционной производительностью используют в препаратах с отражательными перегородками (отбойниками). Отсутствие перегородок приводит к завихрению жидкости, снижению скоро­сти у стенки аппарата и образованию воронки.

Мешалки быстроходные - турбинные, пропеллерные, лопастные, дисковые. Тихоходные - якорные, рамные, ленточные, вибрационные, скребковые; последние для перемешивания средне- и высоковязких сред. Для глубинного культивирования чаще всего используют турбин­ную мешалку с прямыми лопастями, расположенными радиально. Перемешивание культуральной среды влияет на другие параметры:

-скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидкую среду,из среды - в клетки;

-эффективность теплопередачи;

-точность измерения концентрации метаболитов культуральнойжидкости;

-эффективность диспергирования добавляемых реагентов (ки­слот, оснований, питательных сред и т.д.).

Следует соблюдать баланс между необходимостью тщательного пе­ремешивания среды и целостностью клеток, так как при чрезмерном перемешивании в среде могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток.

Непрерывный мониторинг всех параметров, дает возможность из­менять условия в ходе ферментации; Как правило, оптимальные усло­вия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биоре­актора.