8.2. Иммобилизация как путь повышения эффективности и стабильности

Высокая лабильность Ф к различным факторам окружающей среды (значению рН, температуре), быстрая инактивация в организме и выде­ление из организма, наличие антигенных свойств чужеродных организ­му белков - в значительной мере могут быть устранены при использо­вании Ф в иммобилизованном виде.

Иммобилизация Ф - это повышение их стабильности. Существует несколько общепринятых методов иммобилизации Ф, которую прово­дят в строго асептических условиях, но ни один из существующих ме­тодов иммобилизации биологически активных молекул, таких, как Ф, антитела, антигены, не является универсальным.

Самый простой способ иммобилизации Ф — физический метод (ад­сорбция на нерастворимом носителе). В основе метода лежат дейст­вия электростатических сил и сил поверхностного натяжения. Процедуpa иммобилизации состоит в смешивании при соответствующих усло­виях Ф и носителя, инкубации и отделении нерастворимого компонента смеси от растворимого центрифугированием или фильтрованием. Не­достаток этого метода — непрочная связь Ф с носителем. Например, ад­сорбция Ф на носителе ДЭАЭ — сефадекс (диэтиламиноэтил) осуществ­ляется за счёт множественных солевых связей. На такого рода связи влияют даже незначительные изменения рН, ионной силы, температуры и природы растворителя, что может приводить к десорбции фермента с носителя, десорбцию Ф может вызвать даже субстрат. Кроме солевых связей во взаимодействии Ф с носителем могут участвовать и другие слабые силы, например, водородные или ван-дер-ваальсовые.

Материалы, используемые для адсорбции Ф: алюминия оксид, бен­тонит, кальция карбонат, гель кальция фосфата, активированный уголь, целлюлоза, глина белая, коллаген, ионно-обменные смолы, фенольные полимеры, силикагель.

Адсорбция - мягкий метод иммобилизации, который, как правило, слабо влияет на каталитическую активность Ф.

Иммобилизация Ф с помощью ковалентного связывания считает­ся мягким методом. Способ основан на образовании химической связи между молекулами Ф и носителя. При этом важно, чтобы аминокисло­ты, необходимые для проявления каталитической активности Ф, не уча­ствовали в ковалентном связывании с носителем. Способ ковалентной иммобилизаций может приводить к снижению ферментативной актив­ности. Инактивацию можно предотвратить, проводя иммобилизацию в присутствии субстрата, защищающего активный центр. Типичные во-донерастворимые носители, используемые для ковалентной иммобили­зации - агароза (сефароза), целлюлоза, декстран (сефадекс), сополиме­ры полиакриламида, полиаминостирол.

Для ковалентного присоединения требуется предварительная акти­вация носителя. Активированный носитель может реагировать с опре-

ч.

делёнными группами Ф: а- и е-аминогруппами остатков лизина, функ­циональными группами остатков тирозина, гистидина, аргинина, цис-теина. Например, носитель сефароза активирована бромцианом, что основано на реакции между бромцианом и гидроксильными группами сефарозы; образующиеся при этом имидокарбонатные группы могут реагировать со свободными аминогруппами Ф.

Для определения количества Ф, иммобилизованного на носителе, измеряют ферментативную активность исходного раствора, который инкубирован с носителем, и активность, остающуюся в растворе после завершения процесса иммобилизации. Разность между этими активно­стями соответствует теоретическому или максимальному количеству иммобилизованного Ф.

Иммобилизация Ф металлохелатным методом. Для этой цели используют свойства переходных металлов образовывать комплексы. В качестве переходных металлов используют титана хлорид чистый или в кислом растворе, гидроксиды титана, циркония, хрома (их оксиды не токсичны), железа, ванадия, олова. В качестве носителей - производные целлюлозы и силикагели (с соответствующим размером пор), глутаро-вый альдегид. Гелеобразные гидратированные оксиды металлов обра­зуют с Ф нерастворимые комплексы, обладающие хорошей фермента­тивной активностью. На полисахаридных носителях, именно целлюло­зе, получают препараты иммобилизованных Ф с наиболее высокой ак­тивностью.

Например, хелатный комплекс титана хлорида и целлюлозы (D-глюкопиранозы); гидроксильные группы в положении 6 D-глюкопира-нозы, взаимодействуя с ионами титана, образуют полимерный хелат. В нейтральном водном растворе между полимером, активированным ти­тана хлоридом, и Ф образуется ковалентная связь; далее смесь должна быть полностью высушена. Температура высушивания избирательна, но она не должна превышать 50 °С; обычно активирование носителя проводят под вакуумом. Связывание Ф с титановыми комплексами по­лимеров происходит в молекуле Ф по свободным карбоксильным груп­пам кислых аминокислот, фенольным гидроксилам остатков тирозина, спиртовым гидроксильным группам остатков серина и треонина, сво­бодным сульфгидрильным группам остатков цистеина, е-аминогруппам остатков лизина.

Иммобилизация клеток и Ф с включением в гель относится к ме­ханическим методам. Гель, в который включают клетки, как правило, состоит из сферических частиц. Включение живых клеток и Ф требует мягких условий иммобилизации, носитель должен представлять систе­му открытых пор с хорошими условиями для газообмена.

Включение клеток в полиакриламидный гель. Полиакриламид (ПАА) - носитель, чаще других используемый для включения Ф, так как он не обладает ионно-обменными свойствами, поэтому при иммобилизации рН-профиль активности Ф практически не меняется. Для удерживания включённых белков с носителем требуется высокая степень сшивки носителя, т.е. полная полимеризация. Важным фактором при этом явля­ется удаление кислорода из раствора.

Включение клеток в гель кальция алъгината. Альгинат — основной структурный полисахарид бурых морских водорослей. Моновалентные катионы полисахарида даже в низких концентрациях образуют вязкий раствор в присутствии двухвалентных катионов, особенно кальция, что способствовало широкому применению альгината для иммобилизации живых клеток. Ионы кальция можно заменить другими двухвалентны­ми катионами, например бария. Важно отсутствие в системе хелати-рующих агентов, таких, как фосфаты и цитраты, разрушающие структу­ру геля, связывая кальций.

Включение клеток в гели каррагенина. Каррагенины - гетероцикли­ческие полисахариды, содержащие эфиры a-D-галактопиранозил сер­ной кислоты. В водном растворе каррагенин (гель) при добавлении ио­нов кальция образует нерастворимую фракцию.

Включение клеток в гели агара. Препараты клеток, включенных в агар, как и в каррагенин, получают в виде сферических частиц. Иммо­билизацию проводят в растворе, нагретом до температуры, при которой агар остаётся жидким. Затем добавляют клетки и смесь охлаждают до образования геля. Как и в случае с каррагенином, клетки должны быть устойчивы к нагреванию при 40 °С. Иммобилизацию проводят в реак­торе при непрерывном режиме с перемешиванием или в реакторах, ра­ботающих в режиме псевдоожижения. В процессе полимеризации геля молекулы Ф связываются на небольших расстояниях и Ф оказывается заключённым внутри ячеек геля. Размеры пор геля должны быть мень­ше размера молекул Ф, но они не должны препятствовать доступу суб­страта к Ф.

Иммобилизация Ф микрокапсулированием. Основное при этом виде иммобилизации - удержание раствора, окружающего Ф. Иммоби­лизуется целиком исходный раствор, содержащий Ф, а не отдельные молекулы Ф. Преимущество микрокапсулирования — большая площадь поверхности, приходящаяся на единицу активности иммобилизованного Ф, позволяющая использовать высокие концентрации Ф в исходном растворе и достигать большей эффективности действия иммобилизо­ванного Ф. Размер микрокапсул составляет десятки или сотни микрон.

Для предотвращения Ф от инактивации с органическими раствори­телями и мономерами перед микрокапсулированием Ф смешивают с полимерами, способствующими сохранению его активности — бычьим сывороточным альбумином, гемоглобином, ПВП, ПВС, ПЭГ в концен-

трации 1%. Гидрофобные участки полимеров экранируют молекулу Ф, защищая её в процессе микрокапсулирования.

Для образования микросфер в органическом растворителе исполь­зуют эмульгатор (span-85 в концентрации 0,1%) для покрытия поверх­ностей капелек водной фазы, что предохраняет Ф от непосредственного контакта с органическим растворителем.

Физические и химические свойства микрокапсулированных Ф зави­сят от природы полимера, из которого формируется микрокапсула. По­лимер должен обладать когезионными свойствами, обеспечивающими образование непрерывной плёнки, быть проницаем для субстрата, инертным по отношению к реакционной смеси. Для получения микро­капсул используют природные и синтетические полимеры - карбокси-метилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозу, нитрат целлюлозы, желатин, эпоксидные смолы, полиуретаны, стирол, полиамиды.

Для микрокапсулирования ферментных систем чаще всего исполь­зуют коацервацию. Полимерами для коацервации являются - ацетат и нитрат целлюлозы, бутадиеновый каучук.

Микрокапсулирование включает следующие стадии:

1) Растворение Ф в буферном растворе, содержащем для защиты Ф от денатурации другие белки, например альбумин.

2) Приготовление органической фазы, содержащей эмульгирую­щий агент, например, span-85. Органическая фаза не должна смешиваться с водой; обычно это эфир, циклогексан, толуол.

3) Внесение водного раствора Ф в органическую фазу, перемеши­вание в течение заданного времени с определённой скоростью; от скорости перемешивания зависит размер микрокапсул.

4) Добавление к двухфазной смеси второго органического раство­ра, содержащего полимер и органический растворитель (пере­численные на второй стадии). При добавлении второго органи­ческого раствора происходит образование мелкого коллоида, обусловленное разбавлением органического растворителя.

5) Не прекращая перемешивания в условиях вакуума (до 25 мм рт. ст.), отгоняют органический растворитель, при этом происходит дальнейшее осаждение водных микросфер с плотной мембра­ной. Толщина мембраны зависит от количества полимера, до­бавленного к органической фазе и времени преципитации.

6) Выделение микрокапсул из органической фазы центрифугиро­ванием и промывка буферным раствором, содержащим твин-20.

Включение Ф в липосомы. Известно, что липосомы — бислойные сферические образования с водной фазой внутри или полислойные об­разования, состоящие из нескольких концентрических бислоев с внут­ренней полостью и размером до 10 нм.

Для получения липосом Ф или другие БАВ в водных растворах под­вергают УЗ-обработке в присутствии положительно или отрицательно заряженных фосфолипидов.

В зависимости от физических параметров фосфолипидов (заряда, жидкости, размера) липосомы проникают в клетку эндоцитозом или за счет слияния с природными мембранами. При эндоцитозе фосфолипид-ная оболочка липосом внутри клеток разрушается фосфолипазами и Ф высвобождаются в цитоплазму; при слиянии с клеточной мембраной фосфолипидный комплекс липосом входит в состав клеточных мем­бран, активная субстанция поступает в цитоплазму.

Направленность действия липосом может быть изменена за счет со­става компонентов, образующих мембрану, сродство липосом к клет­кам-мишеням усилено специфическими факторами (антителами и др.).

Таблетки и гранулы ферментных препаратов (трипсина, лизоцима, щелочной фосфотазы, каталазы и др.) получают в смеси с биосовмести­мыми полимерами (ПАВ, ПВП, ПВС и др.). Имплантированный в очаг поражения или поблизости от него Ф, находящийся в полимере, прак­тически полностью защищен от воздействия агрессивной физиологиче­ской среды. Из полимера Ф выходит в нативном состоянии, скорость его последующей инактивации и выведения (как и вызываемые им ток­сические, аллергические и иммунные реакции) аналогична нативному Ф, применяемому традиционным способом.

Ферментсодержащие препараты с помощью катетеризации вводят непосредственно в мышечную ткань или в капиллярную сеть поражён­ного органа, иммобилизованные Ф поддерживают там высокую локаль­ную концентрацию.

Иммобилизованные на водорастворимой полисахаридной матрице тромболитические Ф (стрептодеказа, стрептокиназа, целиаза), депони­руемые в место расположения тромба методом катетеризации, эффек­тивны в меньшей дозе.

8.2.3. Иммобилизованные растительные клетки

Известно широкое использование иммобилизованных Ф в качестве стабильных биокатализаторов. Иммобилизованные клетки микроорга­низмов способны относительно долго осуществлять характерные для них биохимические процессы. Иммобилизованные клетки бактерий, грибов способны синтезировать соответствующие антибиотики; главное - подбор метода иммобилизации клеток - продуцентов антибиотиков, позволяющего сохранить способность клеток синтезировать большое количество того или иного антибиотика длительное время.

Растительные клетки весьма чувствительны к изменениям окру­жающей среды, и для их иммобилизации могут быть использованы только наиболее мягкие методы, например включение в гель кальция альгината. С помощью иммобилизации растительных клеток частично или полностью удаётся решить проблемы, связанные с использованием культур растительных тканей для получения сложных органических соединений. Например, иммобилизованные клетки Digitalis lanata спо­собны осуществлять 1-2-Р-гидроксилирование производного дигоксина с образованием дигитоксина - единственного препарата наперстянки, который используется во всём мире.

Разработана технология получения биологически активных веществ из биомассы растительных клеток, культивируемых в ферментерах раз­личной вместимости суспензионным способом. Созданы коммерческие препараты (женьшень, шиконин и др.) Получен патент на штамм жень­шеня ДАН-25.

Иммобилизованные клетки используют при трансформации стеро­идных соединений, так как некоторые стероидтрансформирующие Ф, особенно гидроксилазы и дегидрогеназы, - весьма лабильные белки. В качестве носителей используют ПАА, ПВС, каррагенины, агар, кальция альгинат.

Тест-контроль к главе 8 Выберите правильные ответы:

, 1. Изоэлектрическая точка - это:

А - рН среды, при котором молекула белка не несёт заряда;

Б - рН среды, при котором молекула белка несёт максимальный заряд;

В - рН среды, при котором фермент имеет максимальную ак­тивность;

Г - рН среды, при котором фермент теряет активность.

2. Пептидная связь играет ключевую роль в образовании:

А - первичной структуры белковой молекулы;

Б - вторичной структуры белковой молекулы;

В - третичной структуры белковой молекулы;

Г - четвертичной структуры белковой молекулы.

3. Витамин РР входит в небелковую часть ферментов:

А - НАД зависимых дегидрогеназ;

Б - ФАД зависимых дегидрогеназ;

В - переаминирования аминокислот;

Г - декарбоксилаз.

4.Витамин В₂ входит в небелковую часть ферментов:

А - НАД зависимых дегидрогеназ;

Б - ФАД зависимых дегидрогеназ;

В - переаминирования аминокислот;

Г - декарбоксилаз.

5. Преимущество метода микробиологического синтеза ферментов перед получением их из животного сырья:

А - доступность сырья;

Б - безопасность производства;

В - получение рацемата;

Г-можно использовать более доступные методы стандарти­зации.

6. В состав препаратов, применяемых при гнойно-некротических про­цессах, входят ферменты:

А - аминолитические;

Б - протеолитические;

В - липазы;

Г - дегидрогеназы.

7. Для производства ферментов в настоящее время используется метод промышленного культивирования микроорганизмов:

А - поверхностное культивирование;

Б - глубинное культивирование.

8. Сорбент для гель-фильтрационной очистки белков и ферментов:

А - алюминия окись;

Б - молселект;

В - ионно-обменные смолы;

Г - уголь активированный.

9. Механизм гель-фильтрационного метода очистки белков и фермен­тов основан на:

А - сорбционно-десорбционных процессах на активных центрах;

Б - различной растворимости веществ в фазах сорбента;

В - ионном обмене;

Г - «молекулярном ситовании».

10.В процессе выделения из культуральной среды ферментов и их очи­стки НЕ используется:

А - экстракция;

Б - сорбционные процессы;

В - осаждение (высаливание);

Г - перегонка с водяным паром.

11.Выражение, соответствующее понятию «иммобилизованные фер­менты»:

А - ферменты, сохраняющие значительную активность в широ­ком диапазоне рН;

Б - ферменты, сохраняющие свою структуру и активность дли­тельное время.

12. Химический метод иммобилизации ферментов:

А - образование ковалентных связей между носителем и фер­ментом;

Б - включение фермента в микрокапсулы;

В - включение фермента в полимерные гели;

Г — включение фермента в волокна полимера.

13. Связь, не участвующая в образовании а-спирали из первичной структуры белка:

А — пептидная связь;

Б - водородная связь;

В - ионные взаимодействия;

Г - ван-дер-ваальсовы взаимодействия.

14. Химическая природа кофермента:

А - ионы металлов;

Б - витамины;

В - нуклеотиды;

Г - олигосахариды.

15. Величина аминокислотных остатков, образующих один виток а-спирали, составляет:

А - 0,54 аминокислоты;

Б - 5,4 аминокислоты;

В - 0,36 аминокислоты;

Г - 3,6 аминокислоты.

16. Какая характеристика не относится к растворам белков:

А - растворы высокомолекулярных соединений;

Б - конус Тиндаля;

В - светорассеяние;

Г - светопреломление.

17. Гель-фильтрация - это метод:

А - высаливания белков;

Б - отделения растворителя от раствора;

В - определения заряда белка;

Г - фракционирования белков.

18.Протеомика характеризует состояние микробного патогена:

А - по ферментативной активности;

Б - по скорости роста;

В - по экспрессии отдельных белков;

Г - по нахождению на конкретной стадии ростового цикла.

19.Гены house keeping у патогенного микроорганизма экспрессируются:

А - в инфицированном организме хозяина;

Б - всегда;

В — только на искусственных питательных средах;

Г - под влиянием индукторов.

20.Для получения протопластов из клеток грибов используется:

А - лизоцим;

Б - трипсин;

В - «улиточный фермент»;

Г - пепсин.

21.Для получения протопластов из бактериальных клеток используется:

А - лизоцим;

Б - «улиточный фермент»;

В - трипсин;

Г - пепсин.

22.Выделение и очистка продуктов биосинтеза и оргсинтеза имеют принципиальные отличия на стадиях процесса:

А - всех;

Б - конечных;

В - первых;

Г - принципиальных различий нет.

23.Основное преимущество ферментативной биоконверсии стероидов перед химической трансформацией состоит:

А - в доступности реагентов;

Б - в избирательности воздействия на определённые функцио­нальные группы стероида;

В - в сокращении времени процесса;

Г - в получении принципиально новых соединений.

24. Фермент лигаза, используемый в генетической инженерии:

А - скрепляет вектор с оболочкой клетки хозяина;

Б - катализирует включение вектора в хромосому клеток хо­зяина;

В - катализирует ковалентное связывание углеводно-фосфорной

цепи ДНК-гена с ДНК-вектора;

Г — катализирует замыкание пептидных мостиков в пептидогли-

кане клеточной стенки.

25.Иммобилизация индивидуальных ферментов ограничивается:

А - наличием у фермента кофермента;

Б — наличием у фермента субъединиц;-

В - принадлежностью фермента к гидролазам;

Г - каталитической активностью фермента.

26.Иммобилизация целых клеток продуцентов лекарственных веществ НЕрациональна в случае:

А-высокой лабильности целевого продукта (лекарственного вещества);

Б - использования целевого продукта в инъекционной форме;

В - внутриклеточной локализации целевого продукта;

Г - высокой гидрофильное™ целевого продукта.

27. Целями иммобилизации ферментов в биотехнологическом произ­водстве являются:

А - повышение удельной активности;

Б - повышение стабильности;

В - расширение субстратного спектра;

Г - многократное использвоание.

28.Целевой белковый продукт локализован внутри иммобилизованной клетки. Добиться его выделения, не нарушая системы, можно:

А - усилив системы активного выброса;

Б - ослабив барьерные функции мембраны;

В - присоединив к белку лидерную последовательность от

внешнего белка;

Г - повысив скорость синтеза белка.

29.Экономическое преимущество биотехнологического производства, основанного на иммобилизованных биообъектах, перед традицион­ным обусловлено:

А — меньшими затратами труда;

Б - более дешёвым сырьём;

В - многократным использованием биообъекта;

Г - ускорением производственного процесса.

30.Термин «мультферментный комплекс» означает:

А — комплекс ферментных белков, выделяемый из клетки путём

экстракции и осаждения;

Б - комплекс ферментных клеточных мембран;

В - комплекс ферментов, катализирующих синтез первичного

или вторичного метаболита;

Г - комплекс экзо- и энопротеаз.