9.3. Производство препаратов нормофлоры

Необходимым условием массового производства препаратов эубио-тиков является сохранение их стабильности в течение длительного вре­мени. Бактерийные препараты, содержащие живые микроорганизмы, относятся к наименее стойким, их активность снижается за счет гибели клеток. Микроорганизмы, имея низкий уровень биологической органи­зации, сохраняют жизнеспособность практически при полной потере воды, при этом в них обратимо замедляются или прекращаются обмен­ные процессы. Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий по­казана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой темпера­туры и глубокого вакуума (незначительной концентрации кислорода).

По причине гигроскопичности укупорку сухих биопрепаратов про­водят под вакуумом или в токе инертного газа.

К факторам, оказывающим влияние на выживаемость микроорга-. низмов в препаратах сухих эубиотиков при хранении, следует отнести:

• регламентированное содержание остаточной влаги;

• наличие защитных сред;

• хранение сухих препаратов в атмосфере, не содержащей кисло­род.

В целях защиты эубиотиков от кислой среды желудка на таблетиро-ванные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покры­тия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте.

Производство должно быть организовано в соотвествии с ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарствен­ных средств (good manufacturing practice for medicinal products (GMP))».

Общая схема технологического процесса производства пробиотиков

1.Подготовка производственных помещений, оборудования, посу­ды, персонала, вентиляционной системы - проводят в соответст­вии с требованиями инструкций, регламентирующих условия ра­боты со стерильными лекарственными средствами.

2.Подготовка и стерилизация сред (концентрированной, производ­ственной и защитной среды высушивания). Предварительные ра­боты включают:

-качественный подбор необходимых для данной культуры ве­ществ;

-оценку влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта;

-нахождение оптимального соотношения составляющих и уде­шевление сред.

3. Выращивание маточных (до 6 пассажей) и производственных культур. Вначале выращивают маточную культуру из специаль­ного штамма при температуре 370 °С, используя различные пита­тельные среды. Производственную культуру выращивают мето­дом глубинного культивирования в реакторах, установленных в боксах. Реакторы оснащены магнитной мешалкой и паровой ру­башкой.

4.Розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул. Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию.

5.Сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные ка­меры под углом 750°. Содержимое ампул замораживают при температуре -400 °С, выдерживают при этой температуре 18-24 ч, подвергая сублимации.

6.Укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают (флако­ны укупоривают) с газовой защитой.

7. Маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки по 10 штук.

8. Контроль качества готовой лекарственной формы.

Частная технология препаратов нормофлоры

Лактобактерин. Для производства лактобактерина применяют штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, который относится к роду Lactobacillococcus. Лактобактерий представляют собой грамположи-тельные палочки длиной 0,7-3,0 мкм. Растут в атмосфере СО₂, N₂, О₂.

Лактобактерин сухой (Lactobacterium siccuum) получают по общей схеме для бактерийных препаратов.

/. Приготовление и стерилизация питательных сред:

1. Приготовление гидролизованного молока (к прокипяченному обез­жиренному молоку с рН 7,7±0,1 добавляют панкреатин и хлороформ, выдерживают при 40±2 °С 72 ч, затем фильтруют, разводят вдвое водой для инъекций, разливают в бутыли и стерилизуют).

1.2. Приготовление дрожжевого аутолизата (хлебопекарные дрожжи разводят в бутылях водой для инъекций и стерилизуют).

1.3. Приготовление среды МРС (к гидролизованному молоку добавляют дрожжевой аутолизат и навески следующих веществ: марганца и магния сернокислого, аммония лимоннокислого, глюкозы и др.).

1.4.Приготовление гидролизата казеина (в реакторе готовят раствор казеина, устанавливают необходимое значение рН, добавляют хло­роформ, выдерживают пять суток при 45 °С, затем фильтруют в бу­тыли и стерилизуют).

1.5.Приготовление казеиново-дрожжевой среды.

1.6.Приготовление защитных сред высушивания (желатин, сахароза,

молоко, натрий лимоннокислый и вода).

2. Получение маточной культуры

(6 пассажей в пробирках, чашках Петри, флаконах и бутылях - в тече­ние 9 суток).

3.Выращивание производственной культуры

(в реакторах с жидкой питательной средой в течение 8-12 ч при 370 °С; в 1 мл микробной суспензии производственного штамма должно быть не менее 6 млрд живых микробных клеток; к полученной микробной суспензии добавляют защитные среды высушивания - сахарозно-желатозную или обрат молока).

4.Розлив лактобактерина в ампулы

(доза зависит от концентрации живых микробных клеток).

5.Лиофильная (сублимационная) сушка:

5.1.Замораживание ампул с лактобактерином, расположенных наклон­но под углом 75°, в течение 18-24 ч в холодильной камере до ми­нус 40 °С;

5.2.Лиофилизация (сублимирование) - сушка в условиях глубокого вакуума, длительность сублимации 68-70 ч.

6.Запайка ампул

(в режиме газовой защиты - в атмосфере азота).

7. Контроль качества:

1.1. Описание: кристальная или пористая масса желтовато-белого цвета, кисломолочного запаха и вкуса. Определяют органолептически.

72. Подлинность определяется наличием характерных морфологиче­ских, культуральных и биохимических свойств в производствен­ных штаммах лактобацилл.

7.3.Показатель рН растворенного препарата должен составлять 5,5*0,5.

7.4.Остаточная влажность лактобактерина в ампулах или флаконах не должна превышать 3,5%, в таблетках 5%.

7.5.Растворимость. Сухой препарат должен растворяться в воде, очи­щенной и добавленной из расчета 1 мл на 1 дозу, в течение 5 мин образовывать гомогенную взвесь, желтовато-бежевого цвета. Оп­ределяют визуально.

7.6 Бактериальная контаминация проверяется бактериоскопически и бактериологически.

Бактериоскопически - путем просмотра мазков, приготовленных из взвеси растворенного препарата и окрашенных по Граму. В мазках должны быть клетки, характерные для лактобацилл (грамположи-тельные).

Бактериологически — путем посева на питательные среды и инкуба­ции в течение 2-х суток не должно содержаться колоний. Если обнару­жили рост хотя бы в одной пробирке или чашке, производят повторный посев удвоенного количества образцов.

В случаях повторного роста серию препарата бракуют. Препарат сухой не должен быть контаминирован посторонней микрофлорой. Препарат в таблетках не должен содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; допускается наличие микробов сапрофи-тов в количестве не более 300 на 1 таблетку.

7.7.Специфическая безвредность. Препарат должен быть безвредным для белых мышей при введении его внутрь в количестве одной до­зы. Наблюдение за мышами осуществляется в течение 5 суток. В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши контроль повто­ряют на удвоенном количестве животных. Если мыши не погибнут, препарат считают выдержавшим испытание; в противном случае данную серию препарата бракуют.

7.8.Специфическая активность. По количеству жизнеспособных кле­ток лактобацилл в 1 дозе препарата и активностью кислотообразо-вания.

7.8.1. Определение количества живых лактобацилл в 1 дозе. Для оп­ределения количества живых лактобацилл в одной дозе препарата от каждой серии испытывают не менее 3-х образцов. Содержимое флакона после разведений высевают по 0,1 мл микробной суспензии на 4 чашки Петри. После 44 ч инкуба­ции при t = 37°С производят подсчет выросших колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. 7.8.2. Определение активности кислотообразования проводят тит-риметрическим методом при выращивании бифидобактерий в модифицированной печеночной среде. Каждую пробу титру­ют раствором натрия гидроксида 0,1 моль/л в присутствии индикатора фенолфталеина до появления слабо-розового ок­рашивания. В одной дозе препарата (1 таблетка) при выпуске должно содержаться не менее 2-10⁹ живых лактобацилл. По­казатель активности кислотообразования лактобактерина, выраженный в градусах Тернера (ТО), должен быть не ме­нее 200.

7.9. Определение компонентов стабилизирующей среды высушивания и других веществ, входящих в состав препарата.

8. Маркировка и упаковка

При производстве таблеток лактобактерина микробную суспензию сушат в кассетах. Сухую микробную массу (СММ) протирают через металлическое сито в бутыли с азотом. Таблеточную массу готовят в шаровой мельнице с добавлением к СММ вспомогательных веществ (лактозы, аэросила, кальция стеарата). В таблеточной массе определяют количество живых лактобактерий и рассчитывают массу таблетки. Таб-летирование ведут методом прямого прессования в асептических усло­виях при строгом соблюдении влажности воздуха (не более 50% при 18 °С). Таблетки передают на фасовку во флаконы. Препарат должен находиться в вакууме, атмосфере азота или стерильного воздуха. С це­лью защиты бактерийных препаратов от агресивной кислой среды же­лудка создаются таблетки с ацидорезистентным покрытием, капсулиро-ванные формы, иммобилизованные на сорбенте бактерии. Предприняты попытки создания микрокапсулированных форм пробиотиков.

Продолжительность процесса производства лактобактерина в ампу­лах и таблетках составляет соответственно 42 и 66 суток. Хранят препарат в сухом, темном месте при Г= 5±3 °С. Срок годности 12 и 6 месяцев. Срок годности равен 12 месяцам, ес­ли в одной дозе при выпуске содержится 4 млрд и более живых лактобацилл; 6 - при содержании от 2 до 3,9 млрд. К концу срока годности должно содержаться 1 млрд живых лактобацилл.