§ 3.1. Бактериальные токсины

Состав и свойства пищи, характеризующие ее качество и безопасность для человека, определяются по органолептическим, физико-химическим, микробиологическим, паразитологическим и радиологическим показателям, содержанию потенциально опасных химических соединений и биологических объектов, а также по показателям пищевой ценности продукции.

В некоторых случаях пищевые продукты в процессе получения, переработки, хранения и реализации, особенно при нарушении санитарных правил, могут загрязняться патогенными микроорганизмами, что приводит к возникновению пищевых отравлений и кишечных инфекций.

Токсикоинфекции – острые, нередко массовые заболевания, возникающие при употреблении пищи, содержащей массивное количество (10⁵–10⁶ и более на 1 г или 1 мл продукта) живых возбудителей и их токсинов, выделенных при размножении и гибели микроорганизмов.

Природные токсины, не уступающие по канцерогенной активности антропогенным ксенобиотикам, из-за своей широкой распространенности и очень высокой степени нагрузки на организм человека представляют огромный риск для здоровья населения планеты. Это касается не только развивающихся стран, но и стран с развитой рыночной экономикой.

При остром воздействии наибольшую опасность представляют бактериальные токсины. С точки зрения хронического воздействия и опасности отдаленных последствий на первое место по степени риска выходят микотоксины.

Бактериальные токсины загрязняют пищевые продукты и являются причиной острых пищевых интоксикаций. Рассмотрим наиболее часто регистрируемые интоксикации, связанные с поражением пищевых продуктов некоторыми бактериальными токсинами.

Стафилококк. Staphylococcus aureus – грамположительные бактерии, являющиеся причиной стафилококкового отравления (приложение). Стафилококки представляют собой небольшие клетки шаровидной формы, примерно одинаковой величины. Образуют круглые с ровными краями колонии белого, желтого или золотистого цвета. Оптимальная температура роста 37ºС. Стафилококки продуцируют семь энтеротоксинов: A, B, C₁, C₂, D, E, которые представляют собой полипептиды с молекулярной массой 26360–28500 дальтон. Энтеротоксины S.aureus термостабильны и инактивируются лишь после 2–3 часового кипячения.

Стафилококки устойчивы к действию физических и химических факторов, выдерживают нагревание при 70ºС в течение часа. Термическая обработка пищевых продуктов вызывает гибель стафилококков при условии достаточной ее интенсивности и продолжительности: при температуре 75–80ºС стафилококки отмирают лишь через 20–30 мин, а некоторых случаях требуется прогрев продукта даже при 85ºС. Известно, что стафилококки выдерживают нагревание при 100ºС в течение 35 мин (консервы в масле). Хотя стафилококки не растут при 0ºС, они устойчивы к холоду и выживают длительное время в замороженных средах. Размножение стафилококков задерживается при понижении рН среды до 6,2 или повышении ее до 7,4. Стафилококки устойчивы к высокой концентрации хлористого натрия (до 10% и более). Хорошо переносят высушивание.

Бактерицидным действием по отношению к стафилококкам обладают уксусная, лимонная, фосфорная, молочная кислоты при pH до 4,5. Кроме того, жизнедеятельность бактерий прекращается при концентрации соли (NaCl) – 12%, сахара – 60–70%, вакуумная упаковка также ингибирует рост бактерий. Все это необходимо учитывать в различных технологиях консервирования, как в промышленном масштабе, так и в домашних условиях. Наиболее благоприятной средой для роста и развития стафилококков являются молоко, мясо и продукты их переработки, а также кондитерские кремовые изделия, в которых концентрация сахара составляет менее 50%. В заварном креме энтеротоксин образуется при температуре 30С через 12 ч, а при 37С – через 4 ч.

Стафилококки широко распространены в природе, их можно найти на коже человека, в воздухе, почве и других объектах. Отдельные виды патогенны для человека. Г.Гоббс отмечает, что в носоглотке здорового человека когуалозоположительные стафилококки составляют 30–60%, на руках 15–20% от всего количества бактерий. В большом количестве стафилококки содержатся в гнойничках и нарывах и легко передаются человеком. Стафилококки, особенно золотистые, вырабатывают экзотоксин. Некоторые штаммы образуют энтеротоксин, вызывающий острый гастроэнтерит. По данным Д.Мосселя и других, для образования токсина, вызывающего отравление, требуется минимум 600 тыс. когуалозоположительных стафилококков на 1 г продукта. Некоторые микроорганизмы, например, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Pseudomonas, молочнокислые, задерживают рост стафилококков.

При санитарно-микробиологических исследованиях учитывают только типичные когуалозоположительные штаммы стафилококков.

Сальмонеллы. В 1934 г. по предложению номенклатурной комиссии Международного съезда микробиологов было принято именовать упомянутый род «сальмонелла» (Salmonella). Так была увековечена память микробиолога Сальмона, который первым из исследователей открыл в 1885 г. одного из представителей этого рода бактерий – В.cholerae suis (S.suipestifer).

Возбудители сальмонеллезов относятся к семейству кишечных бактерий рода сальмонелл. Сальмонеллы – короткие бесспоровые палочки, по способу дыхания – факультативные анаэробы и могут размножаться при ограниченном доступе воздуха. Они хорошо размножаются при комнатной температуре, но наиболее интенсивно при 37С и рН 7,2–7,4; хорошо растут на обычных питательных средах, образуя кислоту (и обычно газ) из глюкозы, мальтозы, маннита и декстрина (приложение).

Некоторые виды сальмонелл не погибают при замораживании до –48…–82С и хорошо переносят высушивание. Сальмонеллы устойчивы к воздействию поваренной соли и сохраняют жизнеспособность в мясном рассоле (29% соли) в течение 4–8 месяцев при температуре 6–12С. Они выживают в воде и на различных предметах при комнатной температуре до 45–90 дней. Сальмонеллы чувствительны к тепловой обработке. При нагревании до 60С сальмонеллы выживают в течение часа, при 75С – 5 мин, при 80С они погибают мгновенно. Сальмонеллы гибнут под действием света, особенно ультрафиолетовых лучей. Они более чувствительны в облучению, чем стафилококки, и менее чувствительны чем бактерии группы кишечной палочки.

Сравнительно долго сальмонеллы выживают в пищевых продуктах, причем они не только сохраняют жизнеспособность, но и размножаются, не вызывая изменения органолептических свойств продуктов. В большинстве случаев причина возникновения сальмонеллеза – употребление в пищу различных мясных блюд, приготовленных в основном из мяса крупного рогатого скота, реже из свинины и мяса птиц. Известны случаи передачи сальмонеллезов при употреблении копченой рыбы, в частности сига. Большую опасность представляют изделия, приготовленные из измельченного мяса (фарша), т.к. в процессе измельчения находившиеся в лимфоузлах сальмонеллы распространяются по всей массе фарша, а при неправильном хранении его интенсивно размножаются. Сальмонеллезные токсикоинфекции могут возникать также при употреблении яиц и мяса домашней птицы, особенно водоплавающей. Большое значение как фактор передачи сальмонеллезов имеют молоко и молочные продукты.

При всех формах сальмонеллезной инфекции бактерии проникают в организм человека через рот и могут вызывать клинические или субклинические формы заболевания. Сальмонеллы вызывают три основных типа заболеваний: брюшной тиф, паратифы и энтерит, однако часто встречаются и смешанные формы инфекции.

Бактерии, попавшие в организм человека с загрязненной пищей или водой, проникают в тонкую кишку, откуда они могут распространяться в брыжеечные лимфатические узлы. Затем бактерии проникают через грудной проток в кровяное русло и диссеминируют во многие внутренние органы, включая кишечник, где размножаются в лимфоидной ткани и экскретируются из организма с фекалиями. Инфицирующая доза для людей составляет обычно более 100000 микроорганизмов. Исключительно характерными изменениями являются гиперплазмия и некроз лимфоидной ткани (например, пейеровых бляшек), гепатит, очаговый некроз в печени и воспалительные поражения желчного пузыря, а иногда и других органов и тканей (например, легких, костей).

Патогенность сальмонелл для организма человека проявляется сочетанным действием живых микробов и токсинов. Попав с мясом и другими пищевыми продуктами в желудочно-кишечный тракт, токсические вещества сенсибилизируют слизистую оболочку кишечника и нарушают его ретикулоэндотелиальный барьер. Это способствует быстрому проникновению сальмонеллезных бактерий в кровь и развитию бактериемии. При разрушении бактерий в организме освобождается эндотоксин, который в значительной мере обусловливает клиническую картину токсикоинфекции. Вспышки и случаи токсикоинфекции характеризуются общностью признаков: внезапностью их появления, массовостью и одновременным заболеванием употреблявших одинаковую пищу людей, территориальной ограниченностью и отсутствием эпидемиологического хвоста, то есть отсутствием выделения больных в последующие дни, хотя последнее возможно. Тем не менее, существует многообразие форм клинического их проявления. Накопленные в медицинской практике данные о пищевых токсикоинфекциях сальмонеллезной этиологии позволяют с известной условностью утверждать, что заболевание может иметь гастроэнтеритическую, тифо- или холероподобную, гриппоподобную, септическую и нозопаразитическую формы клинического проявления, а также субклиническую (латентное бактерионосительство). Инкубационный период в среднем 12–24 ч, но иногда затягивается до 2–3 суток.

Гастроэнтеритическая форма проявляется повышением температуры тела, ознобом, тошнотой, рвотой, жидким стулом, иногда с примесью крови и слизи, болью в животе, повышенной жаждой и головными болями. Особенно тяжело, с явлениями неудержимой рвоты и даже поражением нервной системы, протекает заболевание при попадании с пищевыми продуктами в организм человека S.typhimurium.Тифоподобная форма может начинаться с обычного гастроэнтерита и после кажущегося временного выздоровления через несколько дней проявляется признаками, характерными для обычного брюшного тифа.

Гриппоподобная форма, довольно часто встречающаяся при заболевании людей, характеризуется болями в суставах и мышцах, ринитом, конъюнктивитом, катаром верхних дыхательных путей и возможными расстройствами желудочно-кишечного тракта.

Септическая форма протекает в виде септицемии или септикопиемии. При этой форме наблюдаются обусловленные сальмонеллами местные септические процессы с локализацией очагов во внутренних органах и тканях: эндокардиты, перикардиты, пневмонии, холециститы, остеомиелиты, артриты и абсцессы и т.д.

Нозопаразитическая форма представляет собой вторичное заболевание, наслаивающееся на какой-либо первичный патологический процесс и возникающее в результате эндогенного (из кишечника у бактерионосителей сальмонелл) или экзогенного проникновения сальмонелл в организм, ослабленный первичным заболеванием. Клиническая картина и патогенез этой формы сальмонеллезной токсикоинфекции у человека еще недостаточно изучены.

Смертельность при сальмонеллезных токсикоинфекциях в среднем составляет 1–2%, но в зависимости от тяжести вспышек, возрастного состава людей (заболевание среди детей) и других обстоятельств может доходить до 5%.

По данным отечественных и зарубежных авторов, ведущая роль в возникновении пищевых сальмонеллезов, как уже говорилось, принадлежит мясу и мясным продуктам. Особенно опасно в этом отношении мясо и субпродукты (печень, почки и др.) от вынужденно убитых животных. Прижизненное обсеменение мышечной ткани и органов сальмонеллами происходит в результате заболевания животных первичными и вторичными сальмонеллезами. К числу опасных пищевых продуктов с точки зрения возникновения пищевых сальмонеллезов относят фарши, студни, зельцы, низкосортные (отдельная, столовая, ливерная, кровяная и др.) колбасы, мясные и печеночные паштеты. При измельчении мяса в фарш нарушается гистологическая структура мышечной ткани, а вытекающий мясной сок способствует рассеиванию сальмонелл по всей массе фарша и их быстрому размножению. То же самое относится и к паштетам. Студни и зельцы содержат много желатина, а низкосортные колбасы – значительное количество соединительной ткани (рН 7,2–7,3). В этих условиях сальмонеллы также развиваются очень быстро. Нередко сальмонеллоносителями являются водоплавающие птицы, а, следовательно, их яйца и мясо могут быть источником пищевых сальмонеллезов. Реже токсикоинфекции возможны при употреблении в пищу молока и молочных продуктов, рыбы, мороженого, кондитерских изделий (кремовых пирожных и тортов), майонезов, салатов и т.д.

Ботулизм. Clostridium botulinum продуцирует токсины, представляющие особую опасность для человека (приложение). Эти микроорганизмы являются облигатными анаэробами с термостабильными спорами. Различают A, B, C, D, E, F, и G виды ботулотоксинов, причем наибольшей токсичностью обладают токсины A и E. Ботулотоксины имеют белковую природу, молекулярная масса порядка 150 кДа.

Они поражают рыбные, мясные продукты, фруктовые, овощные и грибные консервы при недостаточной тепловой обработке и в условиях резкого снижения содержания кислорода (герметично закупоренные консервы). Кроме того, ботулотоксины характеризуются высокой устойчивостью к действию протеолитических ферментов (пепсин, трипсин), кислот (в частности, к кислому содержимому желудка), низких температур, но инактивируются под влиянием щелочей и высоких температур (80С – 30 мин; 100С – 15 мин). Высокая концентрация хлорида натрия не инактивирует ботулинический токсин. Если в пищевом продукте уже накопился токсин, то консервирование продукта – соление, замораживание, маринование не инактивируют его. Обычно при развитии микробов органолептические свойства продукта заметно не изменяются, иногда лишь ощущается слабый запах прогорклого жира, значительно реже продукт размягчается и изменяется его цвет. В консервах в результате развития микробов и гидролиза белковых и других веществ могут накапливаться газы, вызывающие стойкое вздутие донышка банки (бомбаж).

Ботулизм встречается довольно часто и летальность достигает 7–9%.

К токсинообразующим микроорганизмам, вызывающим пищевые отравления у человека, относятся также Clostridium perfringens – спорообразующие анаэробные грамположительные бактерии, которые продуцируют большое число энтеротоксинов. Споры обычно сохраняются в продуктах и блюдах после их термической обработки (споры термоустойчивых штаммов типа A и F выдерживают кипячение от 1 до 6 ч). При длительном хранении готовой пищи в тепле споры могут прорасти и в течение короткого времени накопиться в огромном количестве. В связи с этим продукты из мяса, молока, рыбы и др., даже хорошо термически обработанные, подлежат быстрой реализации.

Эшерихиоз или кишечная колиинфеция. Эшерихиоз или кишечная колиинфеция – острая кишечная инфекция, вызываемая патогенными (диареегенными) штаммами кишечных палочек, протекающая с симптомами общей интоксикации и поражения желудочно-кишечного тракта (приложение).

Возбудители принадлежат к виду Escherichia coli, роду Escherichia, семейству Enterobacteriaceae, представляют собой грамотрицательные подвижные и неподвижные палочки. Названы они в честь открывшего их в 1885 г. немецкого ученого Т.Эшериха E.coli является обычным обитателем кишечника многих млекопитающихся, поэтому ее часто называют кишечной палочкой. В организме человека E.coli выполняет полезную роль, подавляя рост вредных бактерий и синтезируя некоторые витамины. Однако, существуют разновидности E.coli, способные вызывать у человека острые кишечные заболевания. В настоящее время выделяют более 150 типов патогенных (так называемых «энтеровирулентных») палочек E.coli, объединенных в четыре класса: энтеропатогенные (ЭПЭК), энтеротоксикогенные (ЭТЭК), энтероинвазивные (ЭИЭК), энтерогеморрагические (ЭГЭК).

Патогенные штаммы E.coli (кишечная палочка) являются продуцентами термостабильных токсинов полипептидной природы с молекулярной массой от 4 до 10 кДа и способны вызывать как острые токсикоинфекции, так и являться причиной хронической почечной недостаточности.

Бактерии группы кишечной палочки не устойчивы к высокой температуре: при 60ºС гибель их наступает через 15 мин, при 100ºС – мгновенно. Сохраняемость кишечной палочки при низких температурах и в различных субстратах внешней среды изучена недостаточно. Бактерии хорошо растут на обычных питательных средах, активно ферментируют углеводы. Устойчивы во внешней среде, месяцами сохраняются в почве, воде, испражнениях. По некоторым данным в воде и почве кишечная палочка может сохраняться несколько месяцев. Хорошо переносят высушивание. Обладают способностью к размножению в пищевых продуктах, особенно в молоке. Быстро погибают при кипячении и воздействии дезинфицирующих средств. Обычные дезинфицирующие вещества (фенол, формалин, сулема, едкий натр, креолин, хлорная известь и др.) в общепринятых разведениях быстро убивают кишечную палочку.

Из путей передачи инфекции ведущее место занимает пищевой, особенно молоко и молочные продукты, мясные продукты.

Протеи. Бактерии рода Proteus широко распространены в природе и известны как гнилостные бактерии. Протейные бактерии подвижные, бесспоровые, факультативные анаэробы. Оптимальная температура развития их от 20 до 37С, однако размножение может происходить и при температуре от 6 до 43С. Эти микроорганизмы могут размножаться при pH 3,5–12; выдерживают нагревание до 65С в течение 30 мин; устойчивы к высыханию и высокой концентрации хлорида натрия. Органолептические свойства продукта при массивном обсеменении бактериями рода Proteus не изменяются. Среди многих представителей протейной группы только отдельные виды способны вызывать пищевые токсикоинфекции. Протейная палочка длительное время сохраняет жизнеспособность во внешней среде, в том числе и в пищевых продуктах.

Пищевые токсикоинфекции, вызванные микробами группы протея, возникают преимущественно при употреблении рыбных и мясных блюд, особенно измельченных.

Протеи вызывают заболевание у людей только в тех случаях, когда они выходят за пределы своей экологической ниши (пищеварительный тракт). Их нередко обнаруживают при хронических инфекциях мочевыводящих путей, а также при бактериемиях, пневмониях и очаговых поражениях у ослабленных больных или у больных.

Гигиенические нормативы по микробиологическим показателям продуктов питания включают контроль за 4 группами микроорганизмов:

• санитарно-показательные, к которым относятся: количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов и бактерий группы кишечных палочек (колиформы);

• условно-патогенные микроорганизмы, к которым относятся E.coli, S.aureus, бактерии рода Proteus, B.cereus и сульфитредуцирующие клостридии;

• патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы;

• микроорганизмы порчи – в основном это дрожжи и плесневые грибы.

Регламентирование по показателям микробиологического качества и безопасности пищи осуществляется для большинства групп микроорганизмов по альтернативному принципу, т.е. нормируется масса продукта, в которой не допускаются бактерии группы кишечных палочек, большинство условно-патогенных микроорганизмов, а также патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы. В других случаях норматив отражает количество колониеобразующих частиц в 1 г (мл) продукта (КОЕ/г, мл).

При получении неудовлетворительных результатов анализа хотя бы по одному из микробиологических показателей по нему проводят повторный анализ удвоенного объема выборки, взятого из той же партии. Результаты анализа распространяются на всю партию.

В качестве примера определения микробиологических показателей продуктов питания и для демонстрации особенностей микробиологического анализа по сравнению с химическим анализом уместно привести методику исследования молочных продуктов.

Молоко и молочные продукты относятся к продуктам высокой пищевой и биологической ценности. Молоко содержит необходимые для организма пищевые и биологические активные вещества в оптимальном соотношении, что позволяет рассматривать его как универсальный продукт, обеспечивающий нормальный рост и развитие организма.

Однако вследствие богатого химического состава, высокого содержания воды молоко является благоприятной средой для развития микроорганизмов, которые могут вызывать нежелательные изменения его. На состав и свойства молока могут влиять различные факторы, основными из которых являются: период лактации, возраст, условия кормления и содержания, состояние здоровья животного, условия доения и транспортировки, переработки и сроки реализации.

Отбор проб для микробиологического анализа. Пробы для микробиологических анализов отбирают в стерильную посуду с помощью стерильных приспособлений. Отбор проб и перемешивание продукта перед отбором производят отборником, черпаком, ложкой, металлической трубкой, щупом, шпателем или другим соответствующим приспособлением, которые каждый раз перед использованием должны быть пастерилизованы фламбированием или в автоклаве.

Микробиологический анализ проводят не более, чем через 4 ч с момента отбора проб.

Пробы должны храниться и транспортироваться до начала исследования в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6С, не допуская подмораживания, а для мороженого – не выше минус 2С.

Подготовка к анализу. Перед проведением анализа на дистиллированной воде готовят питательную среду Кесслера (модифицированную), состоящую из пептона, стерильной желчи, лактозы и содержащую кристаллический фиолетовый. Приготовленный раствор разливают в пробирки с поплавками по 5 см³ или колбочки с поплавками по 40–50 см³ и стерилизуют при (1212)С в течение (101) мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.

Подготовка пробы к анализу зависит от того, какой молочный продукт исследуется. Для молока, творога, сыра, мороженого и других продуктов ГОСТом предусмотрены способы подготовки проб.

Методы анализа. Метод определения редуктазы с метиленовым голубым. Метод основан на восстановлении метиленового голубого окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора метиленового голубого и по 20 см³ исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (371)С. При отсутствии редуктазника можно пользоваться водяной баней, помещаемой в термостат с температурой (371)С. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру воды поддерживают в течение всего времени определения (371)С. Для предотвращения влияния на реакцию света редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой. Момент погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Наблюдение за изменением окраски ведут 40 мин, 2 ч 30 мин, 3 ч 30 мин с начала проведения анализа. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания окраски молока. При этом остающийся небольшой кольцеобразный окрашенный слой вверху (шириной не более 1 см) или небольшая окрашенная часть внизу пробирки (шириной не более 1 см) в расчет не принимаются. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов, указанных в таблице 3.1.

Таблица 3.1. – Классы молока в зависимости от продолжительности обесцвечивания

Определение общего количества бактерий. Метод основан на способности мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов размножаться на плотном питательном агаре при температуре (371)С в течение 72 ч.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее верх дном на темном фоне, пользуясь лупой. Каждую подсчитанную колонию отмечают на чашке. При большом числе колоний и равномерном их распределении дно чашки Петри делят на 4 и более одинаковых секторов. Подсчитывают число колоний в 2–3 секторах, находят среднее арифметическое, умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом, находят общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Общее количество бактерий в 1 см³ или в 1 г продукта (Х) в единицах вычисляют по формуле:

X = n·10^m,

За окончательный результат принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам Петри.

Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП). Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37С в течение 24 ч.

По 1 см³ соответствующих разведений продукта засевают в пробирки с 5 см³ среды Кесслера. Пробирки с посевами помещают в термостат при 37С на 18–24 ч. Просматривают пробирки с посевами и по наличию газообразования в них определяют количество БГКП. При отсутствии газообразования через 18–24 ч продукт считают незагрязненным БГКП. По изменению окраски судят о наличии кислоты. Наличие кислоты и газов указывает на наличие БГКП.