2.3.3. Определение аминокислот

В данном разделе будут рассмотрены методы определения аминокислот, применяющиеся не только при анализе продуктов, но в биохимии и фармацевтическом анализе.

Общее количество аминокислот может быть проведено фотометрическим методом, основанным на определении аммиака, полученного из аминокислот по методу Кьельдаля.

Реакция с 1-нафтолом. Для определения аргинина, гистидина, тирозина предложена реакция с 1-нафтолом. В присутствии гипохлорита натрия (NaOCl) раствор окрашивается в красный цвет. Пробу раствора в 50% этаноле, содержащую аминокислоту, охлаждают льдом и добавляют 10% раствор NaOCl и раствор нафтола. Продукт реакции окрашен в красный цвет (_max = 550 нм). По интенсивности окраски полученного раствора определяют содержание аминокислот.

Аргинин Красное соединение 550 нм

Биуретовая реакция. Одной из важнейших реакций, используемых для определения аминокислот, является биуретовая реакция. Реакция осуществляется прибавлением к щелочному раствору биурета разбавленного водного раствора соли меди (II). При этом раствор окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет благодаря образованию комплексного соединения.

Амид аминокислоты

В биуретовую реакцию вступают соединения, содержащие не менее 2-х амидных группировок или аминогидроксиэтиленовую группу, а также амиды и имиды аминокислот. Эту реакцию дают белки и концентрированные растворы аминокислот и амидов. Разбавленные растворы аминокислот не дают биуретовой реакции и поэтому реакцию можно использовать для установления конца гидролиза белка. Реакцию применяют также для качественного и количественного определения белка. На биуретовой реакции основаны используемые в клинико-диагностических лабораториях методики определения белка в крови и других биологических жидкостях.

Нингидриновая реакция. Второй важнейшей реакцией, используемой для определения аминокислот, является нингидриновая реакция – цветная реакция на -аминокислоты, которую осуществляют нагреванием последних в щелочном растворе избытка нингидрина.

Нингидрин осуществляет окислительное декарбоксилирование -аминокислот с образованием аммиака, углекислого газа и альдегида, содержащего на один атом углерода меньше, чем исходная аминокислота. Восстановленный нингидрин далее реагирует с высвободившимся аммиаком и второй молекулой нингидрина, образуя с аммиаком окрашенный продукт конденсации.

Фиолетовый Руэмана

Образующееся соединение (пигмент) имеет фиолетово-голубую окраску (_мах = 570 нм). Образование этого окрашенного соединения используется в количественном тесте на -аминокислоты, с помощью которого можно обнаружить аминокислоты, даже их количество не превышает 1 мкг.

Пролин и гидроксипролин, у которых нет -аминогруппы, в реакции с нингидрином образуют производные желтого цвета (_мах = 440 нм). Реакция не специфична, т.к. окрашенный продукт с нингидрином дают также аммиак и соединения, содержащие аминогруппу (амины, белки, пептиды). Однако с этими соединениями не выделяется CO₂. Выделение углекислого газа характерно только для -аминокислот. Реакция используется для колориметрического количественного определения -аминокислот, в том числе в автоматических аминокислотных анализаторах (измерение объема СО₂).

Нингидриновая реакция используется для определения глицина, изолейцина, лейцина; менее интенсивную окраску дают серин, фенилаланин, цистеин, тирозин, триптофан и др.

Образующиеся продукты характеризуются достаточно интенсивной окраской ( = 1,8–3,3·10⁴), но окрашенные продукты нестабильны. Интенсивность окраски быстро уменьшается. Для стабилизации добавляют CdCl₂. Он образует устойчивые комплексы с образующимися соединениями. Хлорид кадмия также ускоряет реакцию.

Аминокислоты и некоторые другие соединения, содержащие аминогруппу, конденсируются в щелочной среде с 1,2-нафтохинон – 4-сульфоксилотой с образованием окрашенных в красный, желтый, оранжевый цвет производных 1,2-нафтохинонмоноимина.

Окраска зависит от рН раствора.

Имин

Реакция используется для определения -аминоксилот (валин, изолейцин, лейцин, и др.).

Для определения триптофана может быть использована реакция с 4-диметиламинобензальдегидом. Продукт реакции окрашен в фиолетовый цвет и по интенсивности окраски определяют содержание триптофана в анализируемом растворе.

Следует отметить, однако, что данная реакция в анализе пищевых продуктов используется редко.

4-Диметилбензальдегид Фиолетовый 590 нм

Для количественного определения аминокислот, содержащих серу, используется броматометрический метод, основанный на следующей реакции:

Цистеин Цистеиновая кислота

Раствор цистеина в 1% растворе NaOH вливают в колбу с притертой пробкой, добавляют 0,1 н. раствор бромата калия, сухой бромид калия и подкисляют 10%-ной HCl.

BrO₃^– + 5Br^– + 6H⁺  3Br₂ + 3H₂O

Образующийся в результате реакции бром, количество которого эквивалентно количеству бромата калия, реагирует с аминокислотой. Через 10 мин прибавляют йодид калия, который вступает в реакцию с непрореагировавшим бромом, и титруют выделившийся йод 0,1 н. раствором тиосульфата натрия с крахмалом в качестве индикатора.

2I^– + Br₂  Br^- + I₂

Количество тиосульфата, пошедшего на титрование, эквивалентно количеству брома, не вступившего в реакцию с аминокислотой. По разнице между количеством добавленного бромата калия и тиосульфата находят количество брома, пошедшего на реакцию с аминокислотой, а значит и количество аминокислоты.

Метионин определяют аналогично. Метионин при этом окисляется до сульфона:

Эта реакция при определенных условиях позволяет очень точно определить содержание метионина.