2.4.3. Определение углеводов в продуктах питания

Различают следующие основные группы углеводов – простейшие сахара и олигосахариды (моно-, ди- и трисахариды), усваиваемые полисахариды (крахмал, декстрины, гликоген), неусваиваемые полисахариды. Методы определения этих групп углеводов сильно различаются.

Простейшие сахара и олигосахариды. Анализу продуктов питания на углеводы предшествует стадия предварительной подготовки образца. Во время приготовления вытяжек из испытуемых продуктов вместе с сахарами могут переходить и другие вещества (белки, дубильные вещества, пигменты и др.) присутствие которых ведет к искажению результатов. Способы подготовки образца варьируют в зависимости от характера исследуемых продуктов. Наиболее часто применяющимся способом подготовки образца является следующий. Сахара рекомендуется извлекать из пищевых продуктов 3х-кратной экстракцией 80% об. этиловым спиртом при 80ºС. Спиртовые экстракты объединяют и упаривают спирт под вакуумом при температуре не выше 40ºС, разбавляют водой и фильтруют. При анализе продуктов, относительно богатых белками и фенольными веществами (виноград, лук, листовые овощи, свекла) фильтрат дополнительно обрабатывают нейтральным ацетатом свинца или гидратом окиси меди (CuSO₄ + NaOH). Выпавший осадок отфильтровывают. В фильтрате определяют восстанавливающие сахара одним из химических методов – с использованием растворов Фелинга, йодометрическим методом и др.

Для определения общего количества сахара проводят инверсию (нагревание раствора сахара с 0,1 н. раствором соляной кислоты, охлаждение и нейтрализация). Определение отдельных сахаров может быть проведено следующими методами.

1.Взаимодействие с раствором Фелинга. Раствор Фелинга представляет собой щелочной раствор, содержащий CuSO₄ и соль винной кислоты. Смешивают щелочной раствор сегнетовой соли с раствором сульфата меди. Сначала образуется гидрат окиси меди Cu(OH)₂, который взаимодействует с сегнетовой солью и голубой осадок при этом исчезает, а жидкость приобретает густой темно-синий цвет, характерный для готовой Фелинговой жидкости. В ней медь присутствует в виде комплексного иона окиси меди.

При взаимодействии редуцирующего сахара с Фелинговой жидкостью медь (II) восстанавливается до меди (I), а сахар окисляется. Если редуцирующим сахаром является глюкоза, то окисление ее может быть представлено схематически следующим образом:

Глюкоза Глюкуроновая Сахарная

кислота кислота

При действии на раствор восстановителей, в качестве которых выступают углеводы, образуется красный осадок Cu₂O, который отфильтровывают через стеклянный фильтр. При использовании этого метода концентрация углеводов может быть определена тремя путями.

1.В результате взаимодействия раствора Фелинга с углеводами уменьшается интенсивность синей окраски исходного раствора. Строят калибровочный график и определяют количество вступившей в реакцию меди, по которому судят о содержании углеводов в исследуемом растворе. Недостатком метода является быстрое окисление Cu(I) кислородом воздуха.

2.Можно быстро отфильтровать осадок закиси меди и растворить его в смеси растворов аммиака и хлорида аммония. Закись меди быстро растворяется и окисляется кислородом воздуха. Полученный синий раствор аммиаката меди фотометрируют.

3.Метод Сокслета. Определенный объем Фелинговой жидкости титруют до полного восстановления исследуемым раствором сахара и по количеству раствора сахара, пошедшего на титрование, судят о его концентрации, пользуясь эмпирически установленными коэффициентами. Конечная точка титрования – исчезновение синеватого окрашивания. Метод – простой, но конец титрования – не четкий. Метод применяется при концентрации растворов сахара 1–2% и не применим при концентрации менее 1%.

Взаимодействия редуцирующих сахаров с окисью меди не поддаются строгому стехиометрическому описанию, так как в процессе окисления сахара часть его подвергается разрушению щелочью Фелинговой жидкости, а сама Фелингова жидкость при нагревании частично разлагается с выделением закиси меди. Известное значение имеет и окисление кислородом воздуха. Поэтому для количественного определения сахара часто пользуются специальными таблицами, составленными опытным путем или эмпирически установленными коэффициентами.

2.Стандартный метод определения редуцирующих сахаров. Принцип метода тот же, что и в предыдущем методе, с той лишь разницей, что дотитровывание Фелинговой жидкости производится в присутствии метиленовой сини, которая в щелочной среде переводится редуцирующими сахарами в лейко-краску. В связи с этим синий цвет раствора, обусловленный метиленовой синью и сохраняющийся во время титрования, мгновенно исчезает, как только появляется избыточная капля редуцирующего сахара, что указывает на конец реакции.

Восстановление метиленовой сини идет по схеме:

Метиленовая синь Лейкометиленовая синь

Содержание сахара определяют по эмпирически составленной таблице.

3.Йодометрическое определение. Существует два варианта этого метода:

1.Действием щелочного раствора йода (содержание йода точно известно) окисляют альдогексозы с образованием гексоновых кислот. Через 3–10 мин подкисляют разбавленной серной кислотой и титруют избыток йода тиосульфатом натрия в присутствии крахмала.

2.Йодометрическое определение с раствором Фелинга. Углеводы окисляют раствором Фелинга, в котором точно известно содержание меди (2+). Количество меди, не вступившей в реакцию, определяют йодометрически. В результате взаимодействия йодида калия с медью (не восстановленной сахаром) образуется свободный йод, который тотчас же титруют раствором тиосульфата натрия до слабо-желтого окрашивания, добавляют крахмал и титруют далее до исчезновения синей окраски (метод замещения).

CH₂OH-(CHOH)₄-CHO + 2Cu(OH)₂  CH₂OH-(CHOH)₄-COOH + Cu₂О + 2H₂O

2Cu²⁺ + 4I^–  2CuI + I₂

I₂ +2S₂O₃^2– 2I^– + S₄O₆^2–

Находят содержание восстановленной меди и, следовательно, содержание сахара. Этим методом определяют: глюкозу, фруктозу, инвертный сахар, сахарозу, лактозу, мальтозу, маннозу, крахмал после гидролиза и др.

4.Метод с использованием хромотроповой кислоты. Метод заключается в окислении углеводов действием сильного окислителя (KJO₄ + H₂SO₄) с образованием формальдегида. Образующийся формальдегид конденсируется в сернокислой среде с хромотроповой кислотой. Далее продукт конденсации окисляется серной кислотой с образованием окрашенного в фиолетовый цвет продукта (_max = 590 нм).

а)

б)

Полученный раствор фотометрируют. Следует отметить, что пентозы не дают этой реакции, т.е. используя данный метод можно различить гексозы и пентозы.

5.Взаимодействие с солями тетразолия. Бесцветные, растворимые в воде соли тетразолия восстанавливаются до интенсивно окрашенных малорастворимых в воде формазанов, имеющих красную окраску. Метод используется для определения глюкозы, лактозы, фруктозы, инвертного сахара.

Бесцветный Красный

R: C₆H₅ – хлорид трифенилтетразолия

Реакцию проводят в присутствии пиридина и соляной кислоты, добавляемых для растворения продукта. Оптическую плотность полученного раствора измеряют при 490 нм.

6.Окисление пикриновой кислотой. При взаимодействии восстанавливающих сахаров с насыщенным раствором пикриновой кислоты в присутствии карбоната натрия образуется продукт восстановления пикриновой кислоты, окрашенный в буро-красный цвет (_max = 455 нм).

Насыщенный раствор Бурокрасный раствор

желтый 455 нм

Используется для определения: арабинозы, галактозы, глюкозы, крахмала, лактозы, мальтозы, фруктозы.

7.Феррицианидный метод. Определенное количество красной кровяной соли, K₃[Fe(CN)₆], восстанавливается испытуемым раствором редуцирующего сахара в желтую кровяную соль. Реакцию проводят при нагревании.

Красную кровяную соль титруют исследуемым раствором сахара. Индикатор – метиленовая синь.

CH₂OH-(CHOH)₄-CHO + 6K₃[Fe(CN)₆] + 6KOH 

 HOOC-(CHOH)₄-COOH + 6K₄[Fe(CN)₆] + 4H₂O

Окисление глюкозы до сахарной кислоты происходит не сразу, промежуточным продуктом окисления является глюконовая кислота.

Окисление фруктозы протекает по схеме: фруктоза  арабановая кислота  триоксиглютаровая кислота + формальдегид + муравьиная кислота.

Мальтоза и лактоза окисляются еще сложнее. Сахароза, крахмал, декстрины красной кровяной солью не окисляются.

По израсходованному количеству сахара делают заключение о содержании сахара в растворе. Титрование красной кровяной соли сахаром ведется в щелочной среде при нагревании, в присутствии метиленовой сини в качестве индикатора.

Данная реакция также не поддается стехиометрическому выражению, в связи с чем, для расчетов пользуются эмпирически составленными формулами или таблицами.

Феррицианидный метод имеет преимущества перед меднощелочным методом: не образуется осадок закиси меди, конец реакции отмечается высокой степенью четкости, нет необходимости в достаточно дефицитной сегнетовой соли.

8.Перманганатный метод. Метод основан на способности редуцирующих сахаров восстанавливать в щелочном растворе медь (II) в медь (I). Определение сахара проводят путем восстановления железа (III) медью (I) и последующего титрования железа (II) перманганатом калия.

9.Методы определения, основанные на реакциях с участием фурфурола и формальдегида, образующихся при дегидратации углеводов. Дегидратация органических гексоз (глюкоза, манноза, фруктоза) серной кислотой приводит к образованию 5-оксиметилфурфурола, который при нагревании разлагается на формальдегид и фурфурол.

Фурфурол

Продукты дегидратации углеводов могут быть определены различными методами.

1.Альдегиды могут быть определены по реакции с фенолами. Фенолы легко конденсируются с жирными и ароматическими альдегидами:

Продукты конденсации бесцветны, но при их окислении появляется окраска.

Следует отметить, что пентозы образуют только фурфурол (но не формальдегид) и определению гексоз не мешают. Оптическую плотность измеряют при 570 нм, калибровочные графики строят по стандартным растворам глюкозы.

Ряд определений углеводов основан на дегидратации и последующем определении фурфурола, 5-метилфурфурола, которые дают окрашенные продукты с фенолами или нафтолами (реакция Молиша). Окраска продуктов может быть красной, синей, фиолетовой, в зависимости от углевода и фенола. Как правило, при определении гексоз растворы фотометрируют при 490 нм, а пентоз при 480 нм.

2.В сернокислой среде антрон конденсируется с альдегидами с образованием окрашенных соединений по схеме:

Использование этой реакции для определения углеводов основано на том, что при действии концентрированной серной кислоты на углеводы образуется фурфурол, 5-метилфурфурол или 5-оксиметилфурфурол, которые дают с антроном интенсивно окрашенные продукты конденсации зеленого или сине-зеленого цвета с _max = 620–625 нм. Окраска продуктов реакции определяется углеводом, подвергшимся дегидратации.

Зеленый, сине-зеленый

в зависимости от природы УВ

Метод позволяет определять 0,001–0,025% углеводов в продукте и рекомендуется для определения гликогена, декстринов, крахмала, маннозы, а также может быть использован для глюкозы, фруктозы, арабинозы.

Сахарозу определяют после легкого гидролиза разбавленной соляной кислотой. Гидролиз сахарозы приводит к образованию смеси глюкозы и фруктозы, которую называют «инвертным сахаром»: в ней преобладает сильно левовращающая фруктоза (–92º), которая инвертирует (меняет на обратный) знак вращения правовращающего раствора исходной (+66,5º) сахарозы. Угол вращения плоскости поляризации инвертного сахара –39,5º. По углу вращения плоскости поляризации (с помощью поляриметров) определяют содержание сахарозы в растворе. Метод называется поляриметрическим.

В хлебобулочных изделиях сахароза может быть определена биологическим методом, основанным на сбраживании прессованными дрожжами сахара, содержащегося в изделиях.

С₆Н₁₂О₆  2С₂Н₅ОН + 2СО₂

Количество выделившегося углекислого газа определяют газометрическим прибором по объему вытесненного насыщенного раствора поваренной соли или минерального масла. Выделившееся количество углекислого газа пересчитывают на сахарозу.

Качественный и количественный анализ отдельных сахаров проводят методами газо-жидкостной, ионообменной или жидкостной хроматографии высокого разрешения. Количественное определение сахаров проводят также методом ионометрии с использованием ферментных электродов, обладающих исключительно высокой селективностью к определенным сахарам.

Усваиваемые полисахариды. Крахмал. Стандартного метода определения нет. Многочисленные методы плохо воспроизводимы, что зависит от условий их проведения и содержания крахмала в продукте. Однако все методы предусматривают следующие стадии:

1.Освобождение образцов от простых сахаров экстракцией 80% об. спиртом.

2.Извлечение крахмала из продукта одним из способов: растворение сначала в холодной, затем в горячей воде; растворение в солевом растворе; растворение в щелочном растворе; растворение в растворе хлорной кислоты; гидролиз слабой кислотой.

3.Очистка раствора крахмала от белков (фософорно-вольфрамовой кислотой, ацетатом цинка, желтой кровяной солью, уранилацетатом и другими белковыми осадителями).

4.Непосредственное определение крахмала. Его можно провести весовым методом осаждением 90% об. этанолом, химическим методом после кислотного или ферментативного гидролиза по содержанию восстанавливающих веществ или поляриметрическим методом (по вращению плоскости поляризации полученного раствора), но, как правило, определение крахмала проводят путем определения глюкозы после ферментативного или кислотного гидролиза. Для перерасчета глюкозы на исходный крахмал используют соответствующие коэффициенты (0,93). В зависимости от содержания крахмала рекомендуются различные методы, но ферментативные методы могут использоваться независимо от содержания крахмала.

Декстрины. В некоторых случаях в пищевых продуктах (например, в хлебе) определяют декстрины, являющиеся промежуточным продуктом частичного гидролиза крахмала. Их обычно извлекают теплой водой и осаждают 96% об. спиртом. После гидролиза осадка с соляной кислотой определяют восстанавливающие вещества и делают пересчет на декстрины (коэффициент 0,9).

Как и при определении крахмала, навеску продукта сначала обрабатывают этанолом для удаления простых сахаров, после чего из остатка извлекают декстрины теплой водой (не более 40ºС, чтобы не вызвать растворения крахмала). Полученный раствор декстринов доводят до метки водой, аликвотную часть подвергают гидролизу. В гидролизате определяют глюкозу, которую пересчитывают на декстрины.

Неусваемые углеводы. Общее содержание пищевых волокон обычно определяют гравиметрическим методом. Анализ заключается в использовании фракционирования – сначала растворяют крахмал и белки при помощи ферментов, имитирующих расщепление их в желудочно-кишечном тракте человека (-амилаза, пепсин, панкреатин), растворимые пищевые волокна осаждают спиртом, фильтруют, осадок взвешивают.

Пектин. Чаще всего в продуктах встречается так называемый растворимый пектин. Но в некоторых овощах и фруктах, особенно сырых, обнаруживаются заметные количества трудно растворимого, так называемого «протопектина», представляющего в действительности высокомолекулярный пектин.

Стандартного метода определения пектина нет. Результаты различных методов могут значительно различаться. Наиболее воспроизводимые методы определения пектинов включают следующие стадии:

1.Освобождение образцов от простых сахаров.

2.Извлечение пектинов из продуктов. Растворимые пектины извлекают экстракцией холодной водой с последующим кипячением. При необходимости извлечь «протопектин» остаток после извлечения растворимого пектина дополнительно кипятят по 30 мин сначала с 0,3 н. раствором HСl, а затем с 1%-ным раствором цитрата аммония. При анализе продуктов, богатых крахмалом, но содержащих небольшое количество пектинов, сначала извлекают сумму крахмала и пектина гидролизом 0,4–0,6%-ной серной кислотой, затем разрушают крахмал ферментативным путем. Пектины осаждают 96%-ным спиртом. Полученный осадок снова растворяют в горячей воде.

3.Осаждение пектинов. Осаждение, как правило, проводят раствором CaCl₂ и NaOH. В результате образуется нерастворимый комплекс с гидроокисью кальция. Осадок отмывают от хлоридов, высушивают и взвешивают. Вместо взвешивания можно комплексонометрически определить кальций с трилоном Б и по его содержанию вычислить содержание пектинов.

Гемицеллюлозы. По химическим свойствам они весьма близки к пектинам. В их состав входят также пентозы и галактуроновая кислота, однако гидролизуются они труднее. Поэтому их определяют после удаления пектинов теплой водой. Гемицеллюлозы извлекают путем кислотного или щелочного гидролиза. Гидролизаты нейтрализуют и определяют в них редуцирующие вещества. Вычисляют содержание, используя коэффициент 0,9.

Клетчатка. Под пищевой клетчаткой понимают целлюлозу с небольшой примесью лигнина и гемицеллюлоз. Наиболее широкое распространение получили два метода определения клетчатки, различающиеся кислотами, используемыми для гидролиза. Суть методов состоит в гидролизе легкорастворимых углеводов, фильтровании остатка через предварительно взвешенный асбестовый фильтр, высушивании и взвешивании.

Исследуемый продукт обрабатывают последовательно слабой серной кислотой, слабым раствором щелочи, водой, этанолом и эфиром. При этом в раствор переходят все вещества за исключением чистой клетчатки и части гемицеллюлоз и лигнина (нечистая клетчатка). Нерастворившиеся вещества отделяют, высушивают и взвешивают.