2.3.2. Определение общего белка

Состав белков непостоянен. Обычно белки состоят из углерода (50–55%), кислорода (25–30%), азота (9–15%), серы (0,5–2,5%). При анализе продуктов питания часто под словом «белок» понимается количество общего азота, определенного по Кьельдалю, умноженное на соответствующий коэффициент пересчета, указанный в таблицах (в среднем – 6,25). Метод Кьельдаля – один из наиболее широко применяемых методов анализа. Он не требует специального оборудования и удобен для серийного анализа большого количества образцов. Это стандартный метод определения белкового азота в зерне, мясе и других биологических материалах.

Суть метода состоит в том, что анализируемый образец окисляют горячей концентрированной серной кислотой; в процессе окисления связанный азот превращается в ион аммония. Затем раствор обрабатывают избытком сильного основания, в результате чего выделяется аммиак, который определяют различными методами. По способу определения количества выделившегося аммиака метод Кьельдаля может иметь титриметрическое или фотометрическое окончание.

Важнейшей стадией в методе Кьельдаля является окисление серной кислотой. Углерод и водород, содержащиеся в образце, превращаются соответственно в углекислый газ и воду. Степень превращения азота, однако, зависит от его состояния в исходном соединении. Если он присутствует в виде амида или амина, как, например, в белковых веществах, превращение его в ион аммония происходит всегда почти количественно. Если же азот присутствует в высоких степенях окисления, например, в виде нитро-, азо- и азоксигрупп, на стадии окисления образца он превращается в молекулярный азот или оксиды азота и не удерживается серной кислотой. Это приводит к занижению результатов, и чтобы предотвратить потери, образец подвергают предварительной обработке восстановителем (салициловой кислотой или тиосульфатом натрия). При такой обработке азот переходит в соединения с более низкими степенями окисления, из которых он легче превращается в ион аммония при обработке серной кислотой. Стадия окисления является наиболее длительной в методе Кьельдаля – час и более. Для ускорения стараются повысить температуру кипения серной кислоты и, следовательно, температуру процесса окисления, путем добавления нейтральной соли, например, сульфата калия. Попытки ускорить стадию окисления введением таких сильных окислителей, как хлорная кислота, перманганат калия и перекись водорода, оказались неудачными, поскольку ион аммония частично окисляется до летучих оксидов азота.

Стадию окисления катализируют многие вещества: ртуть, медь и селен – как в связанном состоянии, так и в элементном. В качестве катализаторов используют также комбинацию упомянутых веществ. Главный эффект селена состоит в том, что он сокращает время разложения до образования прозрачного раствора, хотя образование совершенно прозрачного раствора не всегда равнозначно количественному разложению вещества. Следует применять незначительное количество селенового катализатора, так как при его увеличении возрастает потеря азота. Продолжительность нагревания тоже не должна быть слишком большой. Таким образом, количество катализатора и продолжительность нагрева имеют оптимум, который необходимо учитывать.

При определении общего азота в колбу Кьельдаля (длиногорлая колба, предназначенная для окисления и отгонки аммиака) помещают точно взвешенную навеску анализируемой пробы в пергаментной бумаге, приливают серную кислоту. Для удаления образующейся пены добавляют кусочек парафина. Колбу помещают на плитку и нагревают. После завершения окисления (жидкость осветлится) содержимое колбы разбавляют водой и добавляют щелочь (30% NaOH) для выделения аммиака. Аммиак отгоняют (часто с водяным паром) в колбу с раствором кислоты.

Титритримеческое определения азота по Кьельдалю. Существуют два титриметрических способа определения собранного аммиака. В одном из них в приемник помещают известное количество стандартного раствора кислоты. По окончании отгонки избыток кислоты оттитровывают стандартным раствором щелочи. Другой удобный способ, требующий применения только одного стандартного раствора, состоит в том, что в приемник вводят некоторый избыток борной кислоты.

HBO₂ + NH₃ = NH₄⁺ + BO₂^–

Образующийся борат, количество которого эквивалентно количеству аммиака, является достаточно сильным основанием и его можно титровать стандартным раствором HCl:

BO₂^– + H₃O⁺ = HBO₂ + H₂O.

Титрование проводится потенциометрически или с использованием индикаторов.

Как уже говорилось, метод Кьельдаля позволяет выделять азот в виде аммиака только из аминов и их производных. Некоторые азотсодержащие соединения (нитро-, нитрозо-, азо-соединения и др.) в этих условиях образуют на ряду с аммиаком молекулярный азот, что приводит к получению заниженных данных. Однако, несмотря на это, метод Кьельдаля нашел широкое применения в биохимии и анализе пищевых продуктов. Метод относительно прост, легко поддается автоматизации и хорошо воспроизводим. В настоящее время процедура определения белка по Кьельдалю стандартизирована в международном масштабе и выпускается оборудование, позволяющее быстро и точно определять содержание общего азота. Такое оборудование включает блок разложения и систему дистилляции. Блоки разложения проб позволяют одновременно разлагать до 12 проб различного объема. Разложение идет под действием серной кислоты с использованием ИК-лучей и максимальная температура процесса может достигать 750ºС. Система дистилляции дает возможность отгонять аммиак с паром и титриметрически (с использованием стеклянного электрода) определять его количество. Следует отметить, что существуют такие системы, в которых и дистилляция, и титрование проводятся в автоматическом режиме и работа, как системы дистилляции, так и блока разложения контролируется микропроцессором, а результаты анализа могут регистрироваться с помощью персонального компьютера.

Фотометрическое определение азота по Кьельдалю. Для ускорения определения аммиака используется его фотометрическое определение. Фотометрически аммиак может быть определен либо по реакции с реактивом Несслера, либо по реакции образования индофенола.

При определении первым способом, к раствору, содержащему ионы аммония, добавляют реактив Несслера, представляющий собой щелочной раствор K₂[HgI₄]. Продукт реакции окрашен в красно-коричневый цвет ( = 10⁶). Оптическую плотность полученного раствора измеряют при 436 нм. Концентрацию аммиака находят по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам сульфата аммония.

Красно-коричневый

436 нм е = 10⁶

Определение, основанное на образовании индофенола, заключается в совместном окислении фенола и аммиака.

NH₃ + NaOCl = NH₂Cl + NaOH

C₆H₅OH + NH₂Cl + NaOH = H₂NC₆H₄OH + NaCl

H₂NC₆H₄OH + C₆H₅OH + NH₂Cl = HOC₆H₄NHC₆H₄OH + NH₄Cl

Полученный индофенол окрашивает раствор в интенсивно синий цвет ( = 620 нм,  = 4,5·10⁴) по оптической плотности которого и определяют содержание аммиака. В качестве окислителей используют NaClO, хлорную или бромную вода, перекись водорода.

Завершая рассмотрения метода Кьельдаля, следует отметить, что этим методом определяют не чистый белок, а так называемый «сырой протеин», так как вместе с азотом белка одновременно определяется азот и других соединений: аминоксилоты, амиды, алкалоиды (кофеин и др.), неорганические азотсодержащие соединения. Содержание небелковых веществ может достигать 10%.

Для перевода количества азота в содержание белка используют коэф­фициент 6,25. Принят он потому, что большинство белков содержит 16% азота (100/6,25 = 16). Однако более правильным является использование коэффициентов, соответствующих фактическому содержанию сырого белка в каждом его виде. Так, для пшеницы получен коэффициент 5,7, так как ее белки содержат 17,5% азота. Для других белковых ресурсов коэффици­енты перевода приняты следующими: 5,7 – рожь, ячмень, овес, семена подсолнечника; 5,8 – соя; 6,25 – кукуруза, мясо; 6,38 – молоко.

Существует и некоторая условность в мето­де Кьельдаля при расчете количества белка, заключающаяся в использо­вании переводного коэффициента. Однако, несмотря на недостатки, метод Кьельдаля, как уже говорилось, является унифицированным, он включен в ГОСТы на многие пищевые продукты.

Имеются и другие методы определения азота, такие как метод Дюма, нейтронно-активационный и с фенолятгипохлоритом на приборе «Тех­никон». Принцип метода Дюма заключается в разложении органическо­го соединения в атмосфере оксида углерода до газообразного состояния с последующим измерением объема азота. В нейтронно-активационном методе атомы азота образца бомбардируются нейтронами в ядер­ном реакторе с получением изотопа ^I3N. Содержание белка рассчитыва­ют по количеству гамма-лучей. Определение азота на приборе «Техни­кон» осуществляется колориметрическим способом, в котором измеря­ется интенсивность сине-голубой окраски, образующейся по реакции вза­имодействия сульфата аммония, выделяющегося в процессе минерали­зации образца, со щелочным раствором фенола и гипохлорита. Все опи­санные здесь методы по точности анализа не уступают методу Кьельдаля, однако они являются достаточно дорогими.

Широкое распространение получил метод инфракрасной спектроско­пии, в основе которого лежит поглощение белками света с определенной длиной волны и измерение интенсивности его отражения в приборах-анализаторах. Приборы калибруют по образцам зерна (эталонам) с изве­стным содержанием белка, определяемым по методу Кьельдаля.

Известны методы количественного определения белка, основанные на различной степени помутнения (нефелометрический метод), способ­ности белков адсорбировать красители (кумасси синий R-250, амидочерный и др.) и преломлять лучи света (по показателю преломления). Они характеризуются высокой точностью и простотой определения, хотя име­ют ряд ограничений. Наиболее удобными являются методы с кумасси синим, биуретовый и Лоури. В основе биуретового метода лежит биуретовая реакция, в основе метода Лоури – восстановление фосфомолибденовой кислоты тирозином и триптофаном с одновременным протека­нием биуретовой реакции. По оптической плотности с использованием калибровочных графиков находят концентрацию белка в растворах.