Глава 1. Общие представления о биотехнологии

Современные биотехнологические производства — сложный ком­плекс взаимосвязанных биофизических, биохимических и физико-химических процессов; в этих технологических процессах производство и биология представляют единое целое.

БТ - это использование культур клеток, бактерий, животных, расте­ний, метаболизм и биологические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. В фармацевтической промышлен­ности БТ охватывает разработку вакцин, синтез гормонов, ферментов, интерферонов, антибиотиков, аминокислот, витаминов, алкалоидов, полисахаридов и других биологически активных веществ (БАВ).

В историческом смысле БТ возникла, когда дрожжи были впервые использованы при изготовлении пива, а бактерии - для получения йогурта.

С 1961 г. БТ тесно связана с исследованиями в области промышлен­ного производства коммерческих продуктов при участии живых орга­низмов, биологических систем и процессов. С этого времени БТ встала на прочный фундамент микробиологии, биохимии и промышленной инженерии.

Промышленный биотехнологический процесс, в котором для произ­водства коммерческих продуктов используются микроорганизмы, обычно состоит из трех ключевых этапов:

1. Исходная обработка: обработка сырья для использования в ка­честве источника питательных веществ для микроорганизма-мишени.

2. Ферментация и биотрансформация: рост микроорганизма-мишени в большом (обычно более 100 л) биореакторе (фермен­тация) с последующим образованием нужного метаболита, на­пример антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформа­ция).

3. Конечная обработка: очистка целевого продукта от компонентов культуральной среды или от клеточной массы (рис. 1).

Цель биотехнологических исследований - максимальное повыше­ние эффективности каждого из этих этапов и поиск микроорганизмов, с помощью которых можно получить целевой продукт.

Наиболее трудным для оптимизации был этап биотрансформации. При использовании природных микробных штаммов выход конечного продукта часто оказывался существенно ниже оптимального. Традици­онные схемы генетического усовершенствования бактерий включают скрининг, отбор и тестирование огромного количества колоний. Такие работы высокозатратны, занимают много времени и при этом можно рассчитывать только на усовершенствование уже существующих, пере­даваемых по наследству свойств штамма, а не на расширение его гене­тических возможностей. И все же к концу 70-х таким образом были усовершенствованы производственные процессы получения целого ря­да конечных продуктов.

С развитием технологии рекомбинантных ДНК природа и возмож­ности БТ резко изменились. Стратегия переноса функциональной еди­ницы наследственности (гена) из одного организма в другой была раз­работана американскими учеными Стенли Козном и Гербертом Бойе-ром в 1973 г. Появилась возможность оптимизировать этап биотрансформации - не просто отбирать высокопродуктивные штаммы микро­организмов и эукариотических клеток, а создавать принципиально но­вые, используя их в качестве «биологических фабрик» по производству инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста, вирусных ан­тигенов и множества других белков. Технология рекомбинантных ДНК позволяет получать в больших количествах ценные низкомолекулярные вещества и макромолекулы, которые в естественных условиях синтези­руются в минимальных количествах. Технология рекомбинантных ДНК - это быстродействующий, эффективный, мощный инструмент, обеспе­чивающий создание микроорганизмов с заранее заданными генетиче­скими характеристиками. Этот инструмент может работать не только с микроорганизмами, но с растениями и животными.

На стыке технологии рекомбинантных ДНК и БТ возникла динамичная, высококонкурентоспособная Молекулярная БТ (МБТ). Биотех­нологическая составляющая МБТ - промышленная микробиология и химическая инженерия; молекулярная составляющая - молекулярная биология, молекулярная генетика бактерий, энзимология нуклеиновых кислот.

История развития МБТ (даты, события)

1917 — введен термин БТ;

1943 - произведен в промышленном масштабе пенициллин;

1944-показано, что генетический материал представляет собой ДНК;

1953-установлена структура инсулина, расшифрована структураДНК;

1961 - учрежден журнал «Вiotechnology and Bioengineering»;

1961-1966 - расшифрован генетический код, оказавшийся универ­сальным для всех организмов;

1953-1976 - расшифрована структура ДНК, ее функции в сохране­нии и передаче организмом наследственной информации, способность ДНК организовываться в гены;

1963-осуществлён синтез биополимеров по установленной струк­туре;

1970 - выделена первая рестрикционная эндонуклеаза;

- осуществлён синтез ДНК;

1972 - синтезирован полноразмерный ген транспортной РНК;

1975 - получены моноклональные антитела;

1976 - разработаны методы определения нуклеотидной последова­тельности ДНК;

1978 - фирма «Genentech» выпустила человеческий инсулин, полу­ченный с помощью Е. соli;

1981 - синтезированы фрагменты нуклеиновых кислот;

1982 - разрешена к применению в Европе первая вакцина для жи-

вотных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК;

1983 - гибридные Ti-плазмиды применены для трансформации растений;

1990-официально начаты работы над проектом «геном человека»; 1994-1995 - опубликованы подробные генетические и физическиекарты хромосом человека;

1996-ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка (эритропоэтина) превысил 1 млрд долларов;

1997 - клонировано млекопитающее из дифференцированной сома­тической клетки;

2003 - расшифрован геном (набор генов, присущий организму) че­ловека, содержащий приблизительно 30 тысяч генов и три миллиарда «букв» молекул ДНК.

В последние годы родилась новая отрасль генетики - геномика, изучающая не отдельные гены а целые геномы. Достижения молекулярной биологии и генной инженерии дали человеку возможность читать генетические тексты вначале вирусов, бактерий, дрожжевых грибков, многоклеточных животных. Например, знание геномной структуры патогенных бактерий очень важно при создании рационально сконст­руированных вакцин, для диагностики и других медицинских целей.Апрель 2003 года ознаменовался сенсацией в биологии и медицине: Международный консорциум по составлению генетической карты че­ловека (Центр геномного секвенирования: Вашингтонский университет я Сенгеровский центр в Кембридже) опубликовал заявление, что уда­лось полностью расшифровать геном человека. Титанический труд сотен исследователей из США, Великобритании, Германии, Франции, Японии и Китая занял более 10 лет и обошелся почти в 3 млрд долла­ров. При этом были разработаны высокоэффективные технологии и ин­струменты картирования, такие как коллекции клеток, в которых есть небольшие фрагменты каждой из хромосом или искусственные дрож­жевые хромосомы, содержащие крупные фрагменты хромосом челове­ка, бактериальные и фаговые векторы, позволяющие размножить (кло­нировать) фрагменты ДНК человека. Быстро прогрессировала техника секвенирования (например, многоканальный капиллярный электрофо­рез ускорил и удешевил расшифровку первичной структуры ДНК). Соз­даны компьютерные программы, позволяющие находить гены в рас­шифрованных участках ДНК.

Ранее было объявлено о «черновой» расшифровке генома человека с точностью 99,9%, сейчас эта точность увеличена на порядок. Осталось заполнить, расшифровать в геноме примерно 400 «дырок». В геноме человека прочитано 3 млрд символов, но решающее значение принад­лежит пониманию смысла прочитанного. Из 30 тыс. генов, составляю­щих геном человека, науке известно о предназначении лишь трети их числа. Полная расшифровка генома человека позволит справиться с множеством недугов, таких как наследственные болезни, рак, заболева­ния сердечно-сосудистой системы, психические и многие другие.

В России существует своя программа «Геном человека», не зависи­мая от Международного консорциума, гораздо более скромная по фи­нансовым возможностям. Ученые на уровне генома изучают связь раз­личных генов с наиболее распространенными заболеваниями, ДНК-диагностику, диагностику хромосомных нарушений, молекулярный ци-тогенетический анализ. Геномная медицина «корректирует» традици­онные методы лечения заболеваний с учетом индивидуальных генети­ческих данных каждого человека. Генетическую обусловленность на­следственных заболеваний определяют около 3 тыс. генов.

Геномные методы идентификации личности, разработанные и прак­тические реализованные в геномике человека, имеют большое значение для общества. Криминалистика получила в свое распоряжение абсо­лютно достоверный метод доказательства: для геномной дактилоскопии достаточно лишь одной капли крови, одного волоса, кусочка ногтя, сле­дов пота, спермы, слюны, перхоти.

Молекулярная биотехнология (МБТ) пользуется достижениями раз­ных областей науки и применяет их для создания разнообразных ком­мерческих продуктов (рис. 2).

Знания и методы биохимии, микробиологии, молекулярной биоло-. гии, генетики, химической технологии, электроники позволяют исполь­зовать потенциал живых клеток в интересах человека. Знания и умения биотехнолога простираются от биохимии и кинетики физиологических процессов в биосистемах (микроорганизм, клетка, вирус) до математи­ческого моделирования, экономики, вопросов управления биотехноло­гическими процессами, объединёнными в сложные системы.

Биотехнология получила возможность воспроизводить нужные про- дукты в неограниченных количествах, используя новые технологии, позволяющие переносить гены в микробные клетки-продуценты или в

организм млекопитающих (трансгенные животные), синтезировать пеп­тиды, создавать искусственные вакцины - это основные биотехнологические процессы, реализующиеся на уровне клетки или с участием от­дельных клеточных структур. В промышленном масштабе подобная БТ

представляет,биоиндустрию.

Г л а в а 2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Характер биологической системы (микроорганизмы, клеточные ли­нии насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организ­мы) исключительно важен для биотехнологического процесса. Во мно­гих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизво­дящаяся биологическая единица (микроорганизм, вирус, растение или животное) является конечным коммерческим продуктом.

Прокариоты и эукариоты. Все живые организмы принято делить на две основные группы: прокариоты и эукариоты. Приблизительно 1,5 млрд лет назад произошел переход от маленьких клеток со сравни­тельно простой внутренней структурой (так называемых прокариот, к которым относятся различные бактерии) к большим по размеру и зна­чительно более сложно устроенным эукариотическим клеткам, подоб­ным клеткам высших животных и растений.

Основные структурные различия про- и эукариот:

• наличие или отсутствие ядра, содержащего хромосомную ДНК;

• строение и химический состав клеточной стенки;

• наличие или отсутствие субклеточных цитоплазматических ор-ганелл.

В прокариотической бактериальной клетке хромосомная ДНК нахо­дится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной кле­точной стенкой. В клетке нет субклеточных цитоплазматических орга-нелл (рис. 3). В оптимальных условиях прокариотическая клетка может делиться каждые 20 мин и таким образом давать жизнь более 10 млрд клеток менее чем за сутки.

В эукариотической клетке (рис. 4) имеется ядро, отделенное от ци­топлазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК находится в ядре. В цитоплазме содержатся различные субклеточные органеляы: мембраны, окружающие ядро, митохондрии, образующие лабиринт эндоплазмати-ческого ретикулума (ЭПР), где синтезируются липиды и мембранные белки. Мембраны формируют стопки уплощенных пузырьков, состав­ляющих аппарат Гольджи, который участвует в синтезе и транспорте различных органических молекул. Мембраны окружают лизосомы (суб-

клеточные структуры диаметром 0,20-0,5 мкм), содержащие гидроли-тические ферменты, необходимые для внутриклеточного пищеварения.

Мембраны, таким образом, защищают от действия этих ферментов бел-ки и нуклеиновые кислоты самой клетки. Мембраны также окружают пероксисомы, содержащие окислительные ферменты, производящие и разрушающие опасные высокореакционоспособные перекиси (пероксиды). Обмен между внутриклеточными, окруженными мембранами струк-\турами и внеклеточной средой происходит с помощью эндоцитоза.

Различают две группы бактерий - эубактерии, населяющие почву, воду и другие организмы, и архебактерии, встречающиеся в таких сре­дах обитания, как болота, океанские глубины, очень соленые воды и горячие кислые источники.

Исходя из температурного режима, который предпочитают те или иные микроорганизмы, их подразделяют на термофилы (от 45 до 90 °С и выше), мезофилы (от 10 до 47 °С) и психрофилы или психротрофы (от -5 до 35 °С). Микроорганизмы, активно размножающиеся лишь в определенном диапазоне температур, - полезный инструмент для реше­ния различных биотехнологических задач. Например, термофилы часто служат источником генов, кодирующих термостабильные ферменты, а генетически видоизмененные психротрофы используются при пони­женной температуре для биодеградации токсичных отходов, содержа­щихся в почве и воде.

Среди множества биологических объектов, использующихся в МБТ, основными «рабочими лошадками» являются бактерии Еscherichia coli, одноклеточные дрожжи Sacharomyces сеrevisiae и различные клеточные линии животного происхождения. Все они играют важную роль в полу­чении белков, кодируемых клонированными генами.

Е. сoli — грамотрицательная непатогенная подвижная палочка дли­ной менее 1 мкм. Традиционная среда ее обитания — кишечник челове­ка, может также высеваться из почвы и воды. Штаммы Е. сoli культиви­руются на обогащенных жидких питательных средах, содержащих ами­нокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода. Е. соН можно культивировать в аэробных и анаэробных условиях, но для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е. соli и другие мик­роорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Рост клеточ­ной массы и продукция белка лимитируются содержанием в питатель­ной среде растворенного кислорода, для этого в ферментерах создают условия аэрации.

Кроме Е. соН в МБТ используют множество других микроорганиз­мов, которые подразделяют на две группы:

• микроорганизмы как источники специфических генов (напри­мер, ген, кодирующий стабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широкоприменяемой полимеразной цепной ре­акции — ПЦР; этот ген был выделен из термофильных бактерий и клонирован в Е. соН).

• микроорганизмы, созданные генноинженернымми методами для решения определенных задач (например, различные штам­мы Согуnebacterium glutamicumт, генетически модифицирова-ные с целью повышения продукции промышленно важных аминокислот).

Saccharomycesс cereае - непатогенные одноклеточные организмы с диаметром клетки около 5 мкм, во многих отношениях представляют эукариотический аналог Е. сoli. S. сегеvisiае размножаются почковани­ем, их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для изготовления напитков и хлеба. Клетки дрожжей делятся каждые 1,5-2 ч. S. сегеvisiае является удобной моде­лью для исследования других эукариот, в т.ч. человека, так как многие гены, ответственные за регуляцию клеточного деления S. ссегеvisiае, сходны с таковыми у человека. Это способствовало идентификации и характеристике генов человека, отвечающих за развитие новообразова­ний. Генетическая система дрожжей является непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека.

Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто подвергают ферментативной модификации, присоединяя к белко­вой молекуле низкомолекулярные соединения, что необходимо для пра­вильного функционирования белка. Однако Е. соН и другие прокариоты не способны осуществлять эту модификацию, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют S. сегеvisiае и другие виды дрожжей.

В качестве биологических систем в МБТ используют культуру эу­кариотических клеток. Кусочек ткани определенного организма (насе­комого, растения, млекопитающего) обрабатывают протеолитическими ферментами (трипсином), расщепляющими белки межклеточного мате­риала; при работе с растительными клетками используют ферменты, разрушающие клеточную стенку. Высвободившиеся клетки помещают в питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витами­ны, соли, глюкозу, факторы роста. В этих условиях (деление клеток млекопитающих происходит примерно раз в сутки) на стенке емкости с культурой образуется клеточный монослой. Если после этого не пере­нести клетки в емкости со свежей питательной средой, рост прекраща­ется. Обычно удается переносить (перевивать, субкультивировать) и поддерживать до 50-100 клеточных генераций исходной (первичной) клеточной культуры, затем клетки начинают терять способность к де­лению и гибнут.

В МБТ устойчивые линии используют для крупномасштабного про­изводства вакцин и рекомбинантных белков, для размножения вирусов и выявления белков, которые кодируются клонированными последова­тельностями ДНК.

Тест-контроль к главам 1-2 Выберите правильные ответы:

1. Определение «Биотехнология - это использование культур кле­ток, бактерий, животных, растений, метаболизм и биологические воз­можности которых обеспечивают получение разнообразных лекарст­венных форм»:

А - верно;

Б — не верно;

В - требует уточнения.

2. Геномика изучает: А - отдельные гены;

Б — совокупность структурных компонентов ДНК;

В - совокупность всех генов организма;

Г - мимические проявления при произношении имени Гена;

Д - механизмы генетических изменений (мутаций).

3. В биотехнологии понятию «биообъект» соответствуют следую­щие определения:

А - организм, на котором испытывают новые БАВ;

Б — организмы, вызывающие микробную контаминацию технологи­ческого оборудования;

В — фермент, используемый для генно-инженерных процессов;

Г - организм, продуцирующий БАВ; Д — фермент, используемый в лечебных целях.

4. Отличительные особенности эукариотической клетки:

А - больший размер;

Б - наличие ядра;

В - ригидная клеточная стенка;

Г — отсутствие субклеточных органелл;

Д - хромосомная ДНК в цитоплазме.

5.Отличительные особенности прокариотической клетки:

А - малый размер;

Б - отсутствие ядра;

В — наличие субклеточных органелл;

Г - многослойная клеточная стенка;

Д - хромосомная ДНК в ядре.

6. Оптимальный температурный режим развития микроорганизмов-мезофилов составляет:

А - 45-90 °С;

Б - 10-47 °С; В - 37 °С;

Г-от-5 до 35 °С;

Д - свыше 90 °С.

7. Типичные направления использования микроорганизмов-психро-филов:

А — источники генов, кодирующих термолабильные ферменты;

Б - источники генов, кодирующих термостабильные ферменты;

В - утилизация токсических отходов;

Г — производство спирта этилового;

Д - производство биогаза.

8. В качестве биологических объектов в биотехнологии используют:

А - Рseudomonas aeruginosa;

Б - Staphylocjccus aureus;

В - Escherichia coli;

Г - С1оstridium tetani;

Д - культуру эукариотических клеток.

9. Способностью превращать (сбраживать) сахар в этанол обладают:

А - Аspergillus oryzae;

Б - Asprgillus terriсо1а;

В — Еscherichia coli;

Г - Ваcillus subtitilis;

Д - Saccharomyces cerevisiае.

10. Отличия Saccharomyces cerevisiае от других прокариотических продуцентов:

А - непатогенность;

Б - аэробный тип развития;

В - анаэробный тип развития;

Г — способность продуцировать полноценные эукариотическиебелки;

Д-неспособность продуцировать полноценные эукариотические

белки.

Г л а в а 3. ДНК, РНК И СИНТЕЗ БЕЛКА

Простые органические молекулы, такие, как аминокислоты или нуклеотиды, ассоциируют с образованием больших полимеров. Две аминокислоты соединяются пептидной связью, два нуклеотида — фос-фодиэфирной. Последовательное повторение этих реакций ведет к об­разованию линейных полимеров, называемых соответственно полипеп­тидами и полинуклеотидами. Полипептиды или белки и полинуклеоти-ды в форме ДНК и РНК считаются наиболее важными компонентами. Универсальные «кирпичики», из которых состоят белки, - это всего лишь 20 аминокислот, а молекулы ДНК и РНК построены только из четырех типов полинуклеотидов. Клетка содержит оба типа полинук-леотидов - ДНК и РНК; в ходе эволюции они специализировались и работают сообща, выполняя каждый свою функцию. Структура поли­нуклеотидов хорошо приспособлена для хранения и передачи информа­ции. Химические различия между двумя типами полинуклеотидов де­лают их приспособленными для решения разных задач. Например, ДНК - хранилище генетической информации, так как ее молекула более ста­бильна, чем молекула РНК. Частично это обусловлено тем, что при на­личии в РНК двух гидроксильных групп этот полинуклеотид в большей степени подвержен гидролизу.

Следовательно, вся информация о строении и функционировании любого живого организма содержится в закодированном виде в его ге­нетическом материале, основу которого составляет ДНК. ДНК - длин­ная двухцепочечная полимерная молекула. В этой скрученной двойным жгутом гигантской молекуле «записаны» все признаки организма. По­следовательность мономерных единиц (дезоксирибонуклеотидов) в од­ной ее цепи соответствует (комплементарна) последовательности де­зоксирибонуклеотидов в другой. Принцип комплементарности обеспе­чивает идентичность исходных и новосинтезированных молекул ДНК, образующихся при удвоении (репликции).

Механизм комплементарного матричного копирования занимает центральное место в процессах переноса информации в биологических системах. Генетическая информация каждой клетки закодирована в по­следовательности оснований ее полинуклеотидов, и эта информация

передается из поколения в поколение благодаря комплементарное™ спаривания оснований.

Индивидуальными генетическими элементами со строго специфич­ной нуклеотидной последовательностью, кодирующими функциональ­ные белки или РНК, являются гены. Гены находятся в ядре клетки, в хромосомах. В некоторых генах всего 800 пар нуклеотидов, в других -около миллиона. У человека 80-90 тыс. генов. Одни гены, называемые структурными, кодируют белки, другие - только молекулы РНК. Ин­формация, содержащаяся в генах, которые кодируют белки, расшифро­вывается в ходе двух последовательных процессов: синтеза РНК, нося­щего название транскрипции и синтеза белка - трансляции. Сначала на определенном участке ДНК, как на матрице, синтезируется мРНК (информационная, матричная РНК) — в клетках животных этот процесс осуществляется в ядре. Затем, перенеся информацию из ядра в цито­плазму, в ходе согласованной работы многокомпонентной системы при участии тРНК (транспортных РНК), мРНК, ферментов и различных белковых факторов осуществляется синтез белковой молекулы. Все эти процессы обеспечивают правильный перевод зашифрованной в ДНК генетической информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот. Аминокислотная последовательность белковой молекулы однозначно задает ее структуру и функции. Нуклеотиды как субъединицы ДНК, РНК выступают также в качестве переносчиков энергии.

Структура ДНК (рис. 5) - это линейный полимер. Его мономерные единицы (нуклеотиды) состоят из азотистого основания, пятиуглерод-ного сахара (пентозы) и фосфатной группы. Фосфатная группа присое­динена к 5'-атому углерода моносахаридного остатка, органическое ос­нование - к 1'-атому. Каждому нуклеотиду присвоено название, соот­ветствующее названию входящего в его состав уникального основания. Основания в ДНК двух типов - пуриновые (аденин — А и гуанин — С) и пиримидиновые (цитозин - С, тимин - Т, урацил - U).

Нуклеотиды существовуют в двух оптических изомерах - L и D. Все без исключения живые организмы для построения своих нуклеоти­дов используют только D-формы. Присутствие даже малого количества L-формы нуклеотидов ингибирует или полностью блокирует работу ферментов синтеза ДНК.

В ДНК моносахарид представлен 2'-дезоксирибозой, содержащей одну гидроксильную группу, в РНК - рибозой, имеющей две гидро-ксильные группы. Нуклеотиды соединены друг с другом фосфодиэфир-ными связями, при этом фосфатная группа 5'- углеродного атома одного нуклеотида связана с 3’-ОН группой дезоксирибозы соседнего нуклеотида. На одном конце полинуклеотидной цепи находится 3’-ОН группа, на другом 5’-фосфатная группа.

Нативная ДНК состоит из двух полимерных цепей, образующих спираль. Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплемен­тарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин обра­зует пару только с тимином, гуанин - с цитозином. Пара оснований А-Т стабилизируется двумя водородными связями, пара С-С - тремя. Длина двухцепочечной ДНК обычно измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов. Например, ДНК хромосомы 1 человека представляет со­бой одну двойную спираль длиной 263 миллиона пар нуклеотидов.

Сахарофосфатный состав молекулы, состоящий из фосфатных групп и дезоксирибозных остатков, соединенных 5'—З'-фосфодиэфирными связями, образует «боковины винтовой лестницы», а пары А-Т и С-С - «ее ступеньки». Цепи молекулы ДНК антипаралельны: одна из них имеет направление 3'—5', другая 5'—>3'. Нуклеотиды считают пара­ми потому, что в молекуле ДНК две цепочки и их нуклеотиды соедине­ны попарно поперечными связями.

Носитель генетической информации должен удовлетворять двум требованиям — воспроизводиться (реплицироваться) с высокой точно­стью и детерминировать (кодировать) синтез белковых молекул. Со­гласно принципу комплементарности, каждая цепь ДНК может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Когда клетке необходимо разделиться, непосредственно перед этим она копирует молекулу ДНК в своих рибосомах. При этом две нити ДНК расходятся и на каждой из них, как на матрице, собирается дочерняя нить, в точно­сти повторяющая ту, что была соединена с данной нитью в родитель­ской клетке. В итоге появляются две идентичные дочерние хромосомы, которые при делении распределяются по разным клеткам. Так происхо­дит передача наследственных признаков от родителей потомкам у всех клеточных организмов, имеющих ядро. Следовательно, после каждого раунда репликации образуются две дочерние молекулы, каждая из ко­торых имеет такую же нуклеотидную последовательность, как исходная молекула ДНК. Нуклеотидная последовательность структурного гена однозначно задает аминокислотную последовательность кодируемого ею белка. Следовательно, каждая цепь ДНК служит матрицей при син­тезе новой комплементарной цепи, а последовательность оснований в синтезируемой (растущей) цепи задается последовательностью компле­ментарных оснований цепи-матрицы.

Синтез ДНК у про- и эукариот осуществляется при участии множе­ства различных ферментов. Основную роль играет ДНК-полимераза, которая последовательно присоединяет звенья растущей полинуклеотидной цепи в соответствии с принципом комплементарности и катали­зирует образование фосфодиэфирных связей.

Для разделения ДНК разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарид, выделяемый из морских водорослей). Предложена модификация гельэлектрофореза в агарозном геле, названная пульс-электрофорез, позволяющая разделять большие молекулы ДНК.

Определены последовательности нуклеотидов генов многих млеко­питающих, включая гены, кодирующие гемоглобин, инсулин, цитохром С. Объём информации о ДНК столь велик (многие миллионы нуклеоти­дов), что для хранения и анализа имеющихся данных необходимы мощ­ные компьютеры.

Для определения того, какие гены активны в данном типе клеток (идентификация специфических последовательностей), используют ме­тод, именуемый ДНК-футпринтинг. Фрагменты ДНК метят Р , затем расщепляют нуклеазами, разделяют на геле и выявляют на радиоавто­графе. Если водный раствор ДНК нагреть до 100 °С и сильно защело-чить (рН 13), то комплементарные пары оснований, удерживающие две цепи двойной спирали вместе, разрушаются и ДНК быстро диссоцииру­ет на две цепи. Этот процесс, называемый денатурацией ДНК, ранее считался необратимым. Но если комплементарные цепи ДНК выдер­жать при температуре 65 °С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали, - процесс получил название ренатурации.

Подавляющее большинство генов содержит в закодированном виде информацию о синтезе белков. Полипептидам присуща большая уни­версальность, они состоят из аминокислот с химически разнообразными боковыми цепочками и способны принимать разные пространственные формы, которые насыщены реакционноспособными участками. Свойст­ва полипептидов делают их идеально подходящими для выполнения разнообразных структурных и функциональных задач. Белки участвуют практически во всех процессах, протекающих в живых системах, они служат катализаторами биохимических реакций, осуществляют транс­порт внутри и между клетками, регулируют проницаемость клеточных мембран, из них строятся различные структурные элементы. Белки - не только основной строительный материал живого организма, многие из них - ферменты, управляющие процессами в клетке. Белки участвуют в осуществлении двигательных функций, обеспечивают защиту от ин­фекций и токсинов, регулируют синтез остальных генных продуктов.

Все аминокислоты имеют сходное химическое строение: к цен­тральному атому углерода присоединен атом водорода, аминогруппа, карбоксильная группа и боковая цепь. Существует 20 разных боковых групп и соответственно 20 аминокислот: например, в аминокислоте аланин боковой цепью является метильная группа (табл. 1).

Пептидная связь образуется между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. Первая аминокислота белковой молекулы имеет свободную аминогруппу (N-конец), последняя - сво­бодную карбоксильную группу (С-конец).

Длина белковых молекул варьирует от 40 до 1000 аминокислотных остатков; в зависимости от их последовательности и аминокислотного состава молекулы белков принимают разную форму (конфигурацию, конформацию). Многие функционально активные белки состоят из двух и более полипептидных цепей, как идентичных, так и несколько разли­чающихся. Белки, выполняющие ключевые функции, представляют со­бой сложные белковые комплексы, состоящие из множества разных полипептидных цепей - субъединиц.

С помощью генетического кода полинуклеотидная последователь­ность определяет последовательность аминокислот в белке; различные триплеты нуклеотидов кодируют специфические аминокислоты.

Важное «передаточное звено» при переводе генетической информа­ции с языка нуклеотидов на язык аминокислот - РНК (рибонуклеино­вые кислоты), которые синтезируются на определенных участках ДНК, как на матрицах, в соответствии с их нуклеотидной последователь­ностью.

Молекулы РНК несут информацию, они обладают химической ин­дивидуальностью, влияющей на их поведение. Молекула РНК обладает двумя важными свойствами: закодированная в её нуклеотидной последовательности информация передаётся в процессе репликации, а уни­кальная пространственная структура определяет характер взаимодейст­вия с другими молекулами и реакцию на внешние условия. Оба этих свойства - информационное и функциональное - являются необходи­мыми предпосылками эволюционного процесса. Нуклеотидная после­довательность молекулы РНК аналогична наследственной информации, или генотипу организма. Пространственная укладка аналогична фено­типу - совокупности признаков организма, подверженного действию естественного отбора.

РНК (рис. 5) — линейная полинуклеотидная молекула, отличающая­ся от ДНК по двум параметрам:

1. Моносахаридом в РНК является рибоза, содержащая не одну а две гидроксильные группы;

2. Одним из четырех оснований в РНК является урацил, занимаю­щий место тимина.

Существование РНК в виде одной нити обусловлено:

отсутствием у всех клеточных организмов фермента для катали­за реакции образования РНК на матрице РНК; такой фермент есть лишь у некоторых вирусов, гены которых «записаны» в ви­де двухнитчатой РНК, остальные организмы могут синтезиро­вать молекулы РНК только на ДНК-матрице; из-за отсутствия метильной группы у урацила связь между аде-нином и урацилом малоустойчива и «удержание» второй (ком­плементарной) нити для РНК является проблемным. По причине однонитчатости РНК, в отличие от ДНК, не закручива­ется в спираль, а образует структуры в виде «шпилек», «петель». Спа­ривание оснований в молекуле РНК происходит таким же образом, как и в ДНК, за исключением того, что вместо пары А-Т, образуется А-U Комплементарные основания, как и в ДНК, соединены между собой водородными связями.

Существуют три основных типа РНК:

информационная (мРНК);

рибосомная (рРНК);

транспортная (тРНК).

Правильность транскрипции, т.е. ее начало и завершение в нужных сайтах (специфических участках), обеспечивают специфические нук- -леотидные последовательности в ДНК, а также белковые факторы. Транскрипция на ДНК осуществляется в клеточном ядре. Молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции белков, аминокислотные последовательности ко­торых закодированы в последовательностях нуклеотидов мРНК (т.е., в конечном счете, в ДНК). мРНК связана с рибосомами, в которых осу­ществляется соединение аминокислот с образованием белков. Рибосо­мы - нуклеотидные частицы, в состав которых входит высокополимер­ная РНК и структурный белок. Биохимическая роль рибосом - синтез белка. Именно на рибосомах происходит соединение отдельных амино­кислот в полипептиды, завершающееся образованием белков.

У большинства прокариот транскрипция всех РНК осуществляется с участием одной и той же РНК-полимеразы. У эукариот мРНК, рРНК, тРНК транскрибируются разными РНК-полимеразами.

С генетической точки зрения ген представляет собой специфиче­скую нуклеотидную последовательность, траскрибируемую в РНК. Большинство транскрибируемых последовательностей ДНК составляют структурные гены, на которых синтезируется мРНК. Конечным про­дуктом структурного гена является белок. У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК. У эукариот большинство структурных генов состоит из нескольких дискретных (отдельных) кодирующих областей — экзонов, разделенных некоди-рующими областями - нитронами. По завершении транскрипции эука-риотического структурного гена интроны вырезаются ферментами из первичного продукта транскрипции, экзоны сшиваются друг с другом «торец в торец» (сплайсинг) с образованием мРНК. Обычно длина эк­зонов составляет от 150 до 200 нуклеотидов, длина интронов варьирует от 40 до 10000 нуклеотидов.

В активно функционирующей клетке примерно 3-5% суммарной РНК приходится на долю мРНК, 90% — на долю рРНК, 4% — на долю тРНК. мРНК может быть представлена десятками различных типов мо­лекул; рРНК - двумя типами. Более крупная рРНК образует с белками рибонуклеотидный комплекс, называемый большой рибосомной субъ­единицей. рРНК меньшего размера — комплекс, называемый малой ри-босомальной субъединицей. При синтезе белков субъединицы объеди­няются с образованием рибосомы. рРНК принадлежит роль главного катализатора в процессе синтеза белка, она составляет более 60% массы рибосомы. В эволюционном аспекте рРНК представляет собой основ­ной компонент рибосомы.

Помимо тысяч рибосом в клетке, активно синтезирующей белки, содержится до 60 различных видов тРНК. тРНК - это линейная одноце-почечная молекула длиной от 75 до 93 нуклеотидов, имеющая несколько взаимно комплементарных участков, спаривающихся между собой. С помощью специфических ферментов (аминоацил-тРНК-синтетаз) к 3'-концу тРНК присоединяется соответствующая аминокислота. Для каж­дой из 20-ти аминокислот, из которых состоят все белки, существует, по крайней мере, одна специфическая тРНК. На другом конце молекул тРНК расположена последовательность из трех нуклеотидов, называе­мая антикодоном, она распознает специфический кадок в мРНК и оп­ределяет, какая аминокислота будет присоединена к растущей полипеп­тидной цепи.

Трансляция (синтез белка) осуществляется при участии мРНК, раз­ных тРНК, «нагруженных» соответствующими аминокислотами, рибо­сом и множества белковых факторов, обеспечивающих инициацию, элонгацию, терминацию синтеза полипептидной цепи.

Нуклеотидная последовательность, в которой закодировано более одного белка, называется опероном. Оперон находится под контролем единственного промотора, и при его транскрипции образуется одна длинная молекула мРНК, кодирующая несколько белков.

Синтез мРНК и соответственно синтез белка строго регулируется, так как у клетки недостаточно ресурсов для одновременной транскрип­ции и трансляции всех структурных генов. Про- и эукариоты постоянно синтезируют только те мРНК, которые необходимы для выполнения основных клеточных функций. Экспрессия остальных структурных ге­нов осуществляется под строгим контролем регуляторных систем, за­пускающих транскрипцию только в случае возникновения потребности в определенных белках. За включение и выключение транскрипции от­вечают дополнительные факторы транскрипции, которые связываются с соответствующими участками ДНК.

При синтезе белковых молекул первичной стадией образования по­липептидной цепи белка является процесс активации аминокислот с помощью аденозинтрифосфата. Процесс активации идет при участии ферментов, в результате чего образуются аминоациладенилаты. Затем под действием фермента аминоацил-тРНК-синтетазы (для каждой из 20 аминокислот имеется свой особый фермент) «активированная» ами­нокислота соединяется с тРНК. Далее комплекс аминоацил-тРНК пере­носится на рибосомы, где происходит синтез полипептида. Пептидная связь образуется между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. Первая аминокислота белковой молекулы имеет свободную аминогруппу (N-конец), последняя - свободную карбок­сильную группу (С-конец).

Сформировавшиеся белки освобождаются из рибосом, а рибосомы после этого могут присоединять новые комплексы аминоацил-тРНК и синтезировать новые белковые молекулы. Рибосомы связаны с мРНК, которая определяет последовательность чередования аминокислот в полипептидных цепочках. Таким образом, целостность и функциональ­ная активность рибосом в клетках - одно из необходимых условий син­теза белковых молекул.

Тест-контроль к главе 3 Выберите правильные ответы:

1. Утверждение «ДНК является хранилищем генетической инфор­мации, потому, что ее молекулы в отличие от РНК более стабильны»:

А - верно;

Б - не верно;

В - требует уточнения.

2. Носитель генетической информации должен удовлетворять тре­бованиям:

А — реплицироваться с высокой точностью;

Б - не подвергаться химическому гидролизу;

В - детерминировать синтез белковых молекул;

Г - выступать в качестве переносчика энергии;

Д - образовывать замкнутую кольцеобразную структуру.

3. Для разделения молекул ДНК используют:

А — высаливание;

Б - обратный осмос;

В - пульс-электрофорез;

Г - гельэлектрофорез;

Д - электродиализ.

4. Отличие молеклы РНК от молекулы ДНК:

А - моносахаридом является дезоксирибоза;

Б - моносахаридом является рибоза;

В - азотистое основание - тимин;

Г — азотистое основание — урацил;

Д — азотистое основание — гуанин.

5. Синтез молекулы ДНК осуществляется:

А - ДНК-лигазой;

Б - ДНК-полимеразой;

В — из L-формы нуклеотидов;

Г - из D-формы нуклеотидов;

Д - из смеси D и L-форм нуклеотидов.

6. Сплайсинг:

А — вырезание из предшественника мРНК экзонов и ковалентное соединение интронов с образованием зрелых молекул мРНК;

Б - вырезание из предшественника мРНК интронов и ковалентное соединение экзонов с образованием зрелых молекул мРНК;

В - синтез зрелых молекул тРНК из путем сшивки отдельных нук-леотидов «торец в торец»;

Г — вырезание из предшественника мРНК интронов и их ковалент­ное соединение с образованием зрелых молекул мРНК;

Д - последовательное ковалентное соединение экзонов и интронов с образованием зрелых молекул мРНК.

7. Ко дон:

А -три соседних нуклеотида мРНК, кодирующих определенную аминокислоту;

Б - три соседних нуклеотида тРНК, комплементарный нуклеотидам специфического кодона в молекуле мРНК;

В -три соседних нуклеотида тРНК, кодирующих определенную аминокислоту;

Г — три соседних нуклеотида тРНК, кодирующих определенную по­следовательность аминокислот;

Д -три соседних нуклеотида мРНК, кодирующих определенную аминокислоту.

8. Уникальная пространственная структура молекулы РНК опреде­ляет:

А - процесс репликации;

Б — генотип;

В — фенотип;

Г - характер взаимодействия с другими молекулами и внешними

условиями; Д - локализацию молекулы РНК.

9. Процессы транскрипции идут:

А - постоянно с одинаковой скоростью;

Б — под контролем регуляторных систем;

В - периодически по мере накопления энергии;

Г — сопряжено с процессами формирования молекул ДНК;

Д -со скоростью, пропорциональной формированию структурных генов.

10. Оперон:

А - участок ДНК, содержащий несколько структурных генов;

Б - участок ДНК, содержащий один структурный ген;

В - нуклеотидная последовательность, кодирующая один белок;

Г - нуклеотидная последовательность, кодирующая более одного

белка;

Д - длинная молекула мРНК, кодирующая несколько белков.