9.6. Серологические реакции и их применение.

Взаимодействие антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция между АГ и АТ состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой АГ. Неспецифическая фаза проявляется видимыми физическими явлениями (образование хлопьев, «зонтика», линии преципитации в виде помутнения).

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от serum– сыворотка).

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции связывания комплемента, иммуноферментный анализ, иммунофлюоресцентный метод, иммуноблотинг.

Реакция агглютинации – РА, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов), она протекает при наличии электролитов.

РА используют для:

1. определения антител в сыворотке крови больного, например при бруцеллезе (реакция Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (р.Видаля), туляремии, коклюше;

2. определения возбудителя, выделенного от больного;

3. определения групп крови.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая,ориентировочная

Для определения у больного антител ставят в пробирках развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов) и через несколько часов инкубации при 37 ⁰С отмечают наиболшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю физиологического раствора. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках. Одновременно учитываются контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе равномерно мутной без осадка. В ориентировочной РА пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов с адсорбированными на их поверхности АГ или АТ, взаимодействие которых с соответствующими АТ или АГ сыворотки крови больных вызывает склеивание и при положительных результатах происходит выпадение эритроцитов на дно полистироловой пластины в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно пластины в виде «пуговки». РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней (дифтерии, дизентерии, сальмонеллеза, туляремии и др.), определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней (гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита).

Реакция преципитации– это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Реакции преципитации ставят в пробирках (р.кольцепреципитации), в гелях, питательных средах. Трупный материал, кожевенное и меховое сырье, из которого трудно выделить сибиреязвенные бациллы, подвергают серологическому исследованию с помощью реакции термопреципитации (реакция Асколи).Реакцию кольцепреципитации проводят в узких преципитирующих пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. В положительных результатах на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.Реакция преципитации в агаре для определения дифтерийного экзотоксина…….

Реакция связывания комплемена (РСК). Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующиеедиенты: 1)испытуемая сыворотка (АТ); 2)антиген – убитая взвесь возбудителей того или иного заболевания; 3) комплемент; 4) гемолитическая сыворотка; 5) эритроциты барана. РСК заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплимент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза – инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело+ комплемент; 2-я фаза индикаторная – выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей к ним антитела. В положительной реакции из-за связывания комплемента с комплексом антиген-антитело гемолиз эритроцитов непроизойдет и они осядут на дно пробирки в виде «зонтика». В отрицательных случаях связывание комплемента с комплексом антиген-антитело не происходит, он остается свободным и присоединятся к комплексу эритроции-гемолитическая сыворотка, тем самым вызывая гемолиз эритроцитов. РСК применяют для диагностики многих инфекционных заболеваний, в частности сифилиса (р.Вассермана), сыпного тифа и др.

Реакция нейтрализациипроводят путем введения смеси антиген-антитело лабораторным животным. Например, для обнаружения ботулинического токсина белым мышам подкожно или внутрибрюшинно вводят вытяжку из остатков пищи (грибы) с антитоксическими ботулиническими сыворотками типов А, В, С, Е. Сыворотки получают из крови лошадей или крупного рогатого скота гипериммунизированых ботулиническими токсинами. При отсутствии у животных повреждающего действия микроорганизмов, их токсинов (мышь осталась жива) говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и ,следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса АГ-АТ.

Реакция иммунофлюоресценции РИФ (метод Кунса).

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминисцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминисцирующей сывороткой светятся в виде каймы зеленого цвета. Данный метод является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или антител.

Иммуноферментный метод (ИФА). Принцип метода следующий: на твердофазном носителе (поверхность лунок полистиролового планшета) фиксируется АГ возбудителя инфекции, антитела к которому необходимо выявить. Антиген, иммобилизованный на поверхности твердого носителя, называют иммуносорбентом. В ходе инкубации иммуносорбента с испытуемой сывороткой при наличие в ней АТ к данному АГ происходит их связывание в комплекс «антиген-антитело». Затем следует инкубация с меченными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгатом), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к комплексу антител, меченых ферментом ( в качестве фермента чаще всего используется пероксидаза хрена). Конъюгат получают на основе поликлональных антивидовых АТ, например кроличьи АТ или моноклональных АТ, направленных против человеческих иммуноглобулинов определенного классаM,G,A. В дальнейшем при добавлении субстрата происходит его взаимодействие с ферментом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных АТ. При использовании пероксидазного конъюгата в качестве субстрата применяют перекись водорода в сочетании с ортофенилдиамином. Результаты реакции оцениваются спектрофотометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В, цитомегаловирусной инфекции, герпесной, токсоплазменной, а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ.

Иммунный блоттинг.В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с последующим подтверждением их специфичности в реакции иммунного блоттинга. Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа. На первом этапе проводится выявление суммарного спектра антител (ИФА), на втором этапе методом иммунного блоттинга проводится определение антител к отдельным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. Белки оболочки вируса ВИЧ1, обозначаемые как гликопротеины («gp» джи пи)с молекулярным весом, выраженным в килодальтонах: 160кд, 120кд, 41кд. У ВИЧ2 гликопротеины имеют вес 140 кд, 105кд, 36кд. Белки сердцевины (gag), обозначаемые как протеины ( «p» пи) у ВИЧ1 имеют молекулярный вес соответственно 55кд, 24кд, 17кд, а ВИЧ2 – 56кд, 26кд, 18кд. Результаты интерпретируются как положительные, в которых обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ. Отрицательными считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антител ни к одному из белков.