3.7. Особенности физиологии грибов, простейших, вирусов и их культивирование.

Грибы по типу питания – гетеротрофы, по отношению к кислороду – аэробы и факультативные анаэробы.

Культивирование грибов производится в аэробных условиях при температуре 22-37⁰С на питательных среда, содержащих азотистые и углеродсодержащие вещества…

По характеру роста на агаровых питательных средах патогенные грибы растут в виде: 1) кожистых, гладких, с плотной консистенцией; 2) пушистых, рыхлых, ватообразной консистенции; 3) бархатисто-ворсистых колоний, покрытых очень густым мицелием; 4) хрупких пленчатых, напоминающих ломкий картон; 5) гипсовидно-мучнистых колоний порошковидной консистенции; 6) мелкозернистых или бугристых кожистой консистенции; 7) крупнобугристых строчковидных колоний; 8) блестящих сальных или матовых колоний сливкообразной консистенции.

На жидких средах многие виды грибов растут в виде войлокообразного осадка на дне и пристеночно. Грибы вырабатывают различного цвета пигменты: белые, желтые, коричневые, черные, синие, зеленые, красные и др.

Некоторые виды патогенных грибов обладают способностью продуцировать экзотоксины: афлатоксины, липотоксол. Большая часть грибов содержит эндотоксины.

Простейшие имеют органы движения (жгутики, реснички, псевдоподии) и выделения (сократительные вакуоли). По типу питания они могут быть гетеротрофами или аутотрофами.

Многие простейшие могут расти на питательных средах, содержащих нативные белки и аминокислоты. Также для культивирования простейших используются культуры клеток (тканей), куриные эмбрионы и лабораторные животные.

Лейшмании выращивают на агаре с дифибринированной кровью кролика на котором они размножаются при температуре 18- 22⁰С и располагаются в виде розетки. Для культивирования трихомонад используют мясо-пептонный бульон с 0,1% глюкозы, 10% сыворотки лошади или человека, 30 ЕД пенициллина и 200 ЕД стрептомицина на 1мл среды, рН = 6,0, инкубируют при температуре 36⁰С в течение 3-6 дней, затем осадок исследуют на наличие трихомонад. Лямблии выращивают в средах, содержащих экстракты дрожжеподобных грибов. Малярийные паразиты развиваются в питательных средах, содержащих кровь с глюкозой, а также на искусственной питательной среде, содержащей метионин и изолейцин. Токсоплазмы выращиваются в развивающихся эмбрионах кур.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и лабораторных животных.

Наиболее широкое применение нашли однослойные культуры трипсинизированных клеток, а также перевиваемые клеточные линии, которые получают из различных органов и тканей животных и человека. Для поддержания их жизнедеятельности использхуют питательные среды (среда 199, Игла и др.), содержащие полный набор веществ, необходимых для роста клеток вне организма (аминокислоты, углеводы, витамины и др.), а также определенный солевой состав и рН.

Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из эмбриональных тканей человека, кур, мышей, овец, свиней, кроликов, морских свинок и других животных, а также почечных клеток взрослых обезьян. Эмбриональные ткани обладают большей потенцией к росту, чем ткани взрослых животных.

Перевиваемые культуры представляют собой штаммы клеток нормальных тканей человека (АО, Л1, FL, ППЧ,Rh), животных (СОЦ – сердце обезьян циномольгус,RК – почки кролика и др.) и ткани злокачественных опухолей (HeLa,Hep-1,Hep- 2,KB, Детройт-6 и др.). Их рост поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей. Так, например, культура клетокHeLa, полученная в 1950 г., к настоящему времени прошла тысячи генераций и используется во всех вирусологических лабораториях мира.

В зараженных культурах ткани одни вирусы проявляют свое цитопатическое действие в течение нескольких дней (вирусы оспы, полиомиелита), другие – спустя 1-2 недели (аденовирусы, вирусы парагриппа). Цитопатический эффект выражается в различных изменениях морфологии клеток, пикнозе ядер, образовании симпластов (гигантские многоядерные клетки), в полной деструкции монослоя. Кроме того, вирусы в зараженных клетках вызывают образование внутриклеточных включений. Выявляют включения с помощью светового или люминисцентного микроскопа после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами, например, тельца Бабеши-Негри при вирусе бешенства, тельца Гварниери при вирусе натуральной оспы. О репродукции вирусов в культуре клеток судят также на основании образования «бляшек», которые представляют собой ограниченные участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое культур клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Подсчитав количество «бляшек», можно определить концентрацию вирусов в исследуемом материале. Кроме того, «бляшки» разных групп вирусов отличаются по размеру, форме, срокам появления. Целый ряд вирусов (гриппа, парагриппа) обладают гемадсорбирующими свойствами, т.е. адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых вирусов в культуре клеток можно использовать реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью. О репродукции вирусов в культуре клеток можно также судить по «цветной реакции». Она регистрируется по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде для культур клеток. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие рН среды и , соответственно, цвет индикатора. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет первоначальный цвет индикатора.

Для культивирования вирусов в курином эмбрионе (5-12 дневные) вируссодержащий материал вводят в амниотическую, аллантоисную полость, желточный мешок, в мозг, тело эмбриона. Специфические поражения в куриных эмбрионах развиваются в виде очагового поражения, диффузного помутнения оболочек, отека с обильными язвами, участками некроза, кровоизлияний, пустул, пузырьков. Репродукцию вируса в курином эмбрионе обнаруживают реакцией гемагглютинации. Недостатком данного метода является то, что многие вирусы не размножаются в эмбрионах птиц.

Культивирование вирусов проводят также в организме чувствительных лабораторных животных, особенно тех вирусов, которые не репродуцируются в культурах тканей и куриных эмбрионах. Взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интрацеребрально и др.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование лабораторных животных для культивирования вирусов также ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека.