12.2. Виробництво ферментів 3 рослинної сировини

12.2.1. ДЖЕРЕЛА ОТРИМАННЯ ФЕРМЕНТІВ

Для одержання ферментів використовується також і рослинна сировина. У багатьох випадках переваги рослин істотні:

• їх заготівля технологічно більш проста;

• висушений матеріал можна компактноупаковувати і збері­гати тривалий час в умовах, що не вимагають спеціального техно­логічного обладнання.

Для виділення ферментів часто використовують насіння рос­лин, багате на білки, і яке може зберігати ферментативну актив­ність протягом багатьох років. До вад рослинної сировини можна віднести сезонність її заготівлі і неоднаковий вміст ферментів у різних частинах рослини та регіонах заготівлі.

Для виробництва протеолітичних ферментів у промислових масштабах в основному використовують сировину, наведену в табл. 12.2.

Фармацевтичні виробництва нашої країни рослинні протеї-нази не виробляють, оскільки більшість рослин, що їх продукує, в основному зростають у тропічних країнах.

У лабораторії ферментних препаратів ДНЦЛЗ, яка є єдиною за профілем своєї діяльності в країнах СНД, вперше отримано рослинні препарати медичного призначення різної специфіки дії:

264

265

Таблиця 12.2 Сировина для виготовлення протеолітичних ферментів

• уреаза зі столових кавунів (Citrullus vulgaris L.);

• ліпаза з насіння чорнушки дамаської (Nigella damascena L.);

• Р-амілаза з пророслого насіння пшениці (Triticum aestivum L.);

• Р-галактозідаза з насіння гороху (Pisum sativum L.);

• інгібітор ліпази з насіння рапсу (Brassica napus L.);

• інгібітор трипсину з насіння люцерни (Medicago sativa L.);

• інгібітор амілази з пшениці (Triticum aestivum L.);

• Р-фруктофуранідаза з насіння вівса (Avena sativa L.).Для виробництва ферментів можуть бути також використані

продукти бджільництва. Відомо, що бджолиний мед має дуже виявлену активність ферменту амілази (діастази).

12.2.2. ТЕХНОЛОГІЯ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

Технологія ферментних препаратів характеризуєть­ся різко вираженим індивідуальним підходом, зумовленим харак­тером вихідної лікарської рослинної сировини, властивостями фер­ментів та супутніх їм речовин.

Зазвичай ферменти в рослинній сировині знаходяться у ви­гляді складних комплексів, і для того, щоб їх одержати в криста­лічному стані і біологічно активними, у першу чергу необхідно підібрати такі методи виділення, щоб при цьому не втрачалася їхня специфічна активність.

Загальні принципи технологічних прийомів, включаючи під­готовку сировини та обладнання і закінчуючи одержанням очи­щеного препарату, не є уніфікованими, а формуються і застосову­ються залежно від завдань технології, типу та індивідуальних особливостей ферменту.

Перед екстракцією ферменту вихідну сировину піддають здріб­нюванню для руйнації клітин, використовуючи промислові мли­ни (вальці, дезінтегратори, дисмембратори).

266

Як екстрагент ферменту використовують воду, водні розчини органічних розчинників (спиртів, ацетону, ефіру, діоксану), роз­ведені розчини кислот і лугів, розчини нейтральних солей, а та­кож буферні розчини. Екстрагент підбирається індивідуально для кожної рослинної сировини, що містить фермент. Гідролітичні ферменти, наприклад, амілази і протеїнази, найбільш повно екс­трагуються з рослинної сировини за допомогою води.

Екстракт, отриманий у результаті вибіркової екстракції, по­ряд із ферментами містить супутні білки, ліпіди, пігменти, неор­ганічні іони, полісахариди та інші речовини неферментної приро­ди. Видалення супутніх компонентів і досягнення високого ступеня очищення ферментного білка вимагає поєднання різних методів виділення. На першій стадії очищення екстракту може бути ви­користана кислотна денатурація, яка дозволяє за рахунок змі­щення pHсередовища перевести білки у нерозчинний стан. Іноді, з обережністю, проводять їх температурну денатурацію шляхом короткочасного прогрівання екстракту при температурах, які не спричиняють денатурацію ферменту, що виділяється. Зазначені методи можуть поєднуватися. Застосовують також осадження не­активних домішок солями важких металів. 3 метою очищення екстракту від компонентів, що відрізняються розмірами молекул, застосовують діаліз через мембрани з певним розміром пор (цело­фан, колодій, пергамент). Використовують також стандартні мемб­рани з целюлози і її похідних. Електродіалізом користуються рід­ко через небезпеку місцевого нагрівання і можливість небажаної зміни pH.

Шсля попереднього очищення, а іноді і без нього, екстракт піддають фракціонуванню органічними розчинниками, нейтраль­ними солями, сорбції-десорбції на різноманітних адсорбуючих матеріалах, очищенню за допомогою іонообмінних смол, гель-фільтрації тощо.

Фракційне очищення. Для фракційного очищення із застосу­ванням органічних розчинників використовують спирти (етанол, метанол, ізопропанол, ацетон, інколи діоксан, діетилкарбінол, ароматичні та гетероциклічні аміни).

Для зменшення денатураційного впливу дії осадження ведуть при знижених температурах.

При фракціонуванні ферментів під дією солей часто викорис­товують амонію сульфат, інколи застосовують натрію і магнію сульфати та ацетати. На відміну від органічних розчинників, які порівняно легко віддаляються центрифугуванням, сольові осад­ники з отриманого матеріалу можна видалити діалізом, який по­требує багато часу.

Ферменти мають здатність адсорбуватися на активованому вугіллі, крохмалі і його похідних, гідроксидах цинку, магнію, алюмінію, міді, на бетонітах, каоліні, гелі кальцію трифосфату, целюлозі і її похідних та інших матеріалах.

267

• сульфометилцелюлозу (СМЦ);

• сульфоетилцелюлозу (СЕЦ);

• карбоксиметилцелюлозу (КМЦ);

• фосфоцелюлозу (ФЦ).

Застосування знаходять також іоніти, що мають у своєму складі основну групу:

• аміноетилцелюлоза (АЕЦ);

• діетиламіноетилцелюлоза (ДЕАЕЦ);

• етилцелюлоза (ЕЦ);

• триетиламіноцелюлоза (ТЕАЦ);

• гуанідиноетилцелюлоза (ГЕЦ).

Розділення і концентрування. Для розділення і концентру­вання ферментних білків часто застосовують метод гель-фільтра-ції з використанням сефадексів —полімерних ланцюгів полісаха­риду декстрину, з'єднаних через певні проміжки поперечними зв'язками, що утворюють своєрідні молекулярні сита, здатні роз­діляти білки за їх молекулярною масою.

Для концентрування ферментного білка часто використову­ють ультрафільтрацію. Метод полягає у розділенні високомолеку-лярних і низькомолекулярних сполук на селективних мембранах, здатних пропускати низькомолекулярні сполуки під дією тиску. Ультрафільтрація в 5—10разів ефективніша за очищення з вико­ристанням фракціонування етанолом.

Кристалізація ферментів. Кристалізація ферментів є склад­ним методом їх очищення і застосовується для субстанцій, які пройшли концентрування і багатоступінчасте очищення.

Кристалічний стан не є критерієм гомогенності ферментного білка, а вимагає додаткового підтвердження іншими методами (диск-електрофорезом у поліакриламідному гелі, ультрацентри­фугуванням тощо). Методи і технологія кристалізації підбираються індивідуально для кожного ферменту.

12.2.3. ТЕХНОЛОГІЯ ОДЕРЖАННЯ ІНДІВІДУАЛЬНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ РОСЛИННОГО ПОХОДЖЕННЯ

Технологічний процес промислового виробництва фермен­тів рослинного походження (табл. 12.3)складається в основному з таких стадій:

• екстракція лікарської рослинної сировини;

• виділення й очищення ферменту;

• висушування;

• стандартизація;

• одержання лікар­ських форм.

Уреазу (Ureasum)одер­жують із насіння столово­го кавуна (Citrullus vulga­ris L.).Технологія цього препарату розроблена C.I.Дєхтярьовим СДНЦЛЗ).

Попередньо здрібнене насіння столового кавуна за допомогою валкової дробарки екстрагують у реакторі при періодично­му перемішуванні суміш­шю розчину солей натрію хлориду і натрію карбона­ту (pH= 7,9...8,1)протя­гом 2год при температу­рі 22±2 °С.Після закін­чення зазначеного часу вміст реактора переносять на конус обертового ба­рабана центрифуги. Як фільтрувальний матеріал використовують бязь, якою покривають барабан у два шари. Частота обер­тання ротора центрифуги 3000об/хв. Мутний екст­ракт із приймача центри­фуги переносять порція­ми в стакан центрифуги. Повторне центрифугуван­ня здійснюють протягом 30хв. Екстракт акуратно зливають у посудину і по­міщають у холодильну шафу для охолодження до 10°С.

Виділення уреази з ек­стракту здійснюють у ре­акторі його обробкою на­сиченим розчином амонію сульфату в буферному роз-

268

269

чині (pH= 7,0)при періодичному перемішуванні. Суспензію оса­ду білка, що утворилася, відстоюють протягом 6год. Після закін­чення зазначеного часу суспензію з реактора переносять порція­ми в стакани центрифуги і центрифугують протягом 20хв. Осад супутнього білка відкидають, а рідину, що знаходиться над оса­дом, знову подають у реактор.

Проводять друге висолювання, додаючи в реактор насичений розчин амонію сульфату у кількості 1/2об'єму від початкової. Суспензію в реакторі залишають на 12год. Після цього осад біл­ка, який складається з активного ферменту, відокремлюють центрифугуванням протягом 30хв при частоті обертання ротора 3000об/хв. Отриманий осад розчиняють в очищеній воді і охоло­джують у холодильній шафі до температури 10 °С.

Потім здійснюють фракційне осадження ферменту етанолом, додаючи його в розчин у співвідношенні 1 : 2.Суспензію утворе­ного ферменту переносять порціями в стакани центрифуги і центри­фугують протягом 15хв. Осад активного ферменту у вигляді ма­зеподібної маси залишається на дні стаканів. Осад розчиняють у воді очищеній і сушать методом сублімації з оптимальним ре­жимом температур від -40до 30 °С.Тривалість заморожування-висушування 2—3год, досушування — 8—10год.

Після висушування порошок фасують у склянки із оранжо-вого скла місткістю 0,2л. Вихід препарату 0,3 %.Активність не менше 1500ОД Самнера в 1г препарату або 100—200ФО (фер­ментних одиниць) в 1мг білка.

Уреаза каталізує реакцію гідролізу сечовини на вуглекислий газ і амоніак. Застосовують мікрокапсульовану уреазу для очи­щення крові від сечовини і для проведення гемодіалізу в апараті «штучна нирка».