9.2. Промислове виробництво бар 13 культури клітин рослин

В основі промислового виробництва БАР із культури клітин рослин лежить ряд послідовних стадій і операцій: одер­жання високопродуктивних продуцентів, розробка найбільш спри­ятливих умов культивування продуцента БАР із максимальним

204

205

біосинтезом цієї речовини, добір і впровадження в практику від­повідних методів виділення та очищення БАР, створення готових препаратів і контроль якості. Робота на кожному з цих етапів має проводитися кваліфікованими фахівцями (технологами, біотех-нологами, генетиками).

9.2.1. ПІДГОТОВКА СЕРЕДОВИЩА

ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ПРОДУЦЕНТА

IПОСІВНОГО МАТЕРІАЛУ (ПЕРША СТАДІЯ)

Підготовка середовища. Для кожного продуцента БАР, для кожного наново утвореного калусу і суспензійної куль­тури рослин розробляється своє оптимальне середовище, яке по­винне задовольняти основним вимогам: а) забезпечувати добрий ріст біомаси і максимально утворювати БАР (алкалоїди, глікози­ди, полісахариди, терпеноїди та ін.); б) містити доступні за варті­стю компоненти; в) забезпечувати застосування найбільш еконо­мічних і ефективних способів виділення та очищення БАР.

Середовище для культивування'. Компоненти середовища для вирощування калусних і суспензійних культур можна розділити на шість груп, що звичайно відображає порядок готування кон­центрованих вихідних розчинів:

1. основні поживні речовини (макроелементи);

2. мікроелементи;

3. джерела заліза;

4. органічні добавки (вітаміни);

5. джерела вуглецю;

6. регулятори росту рослин.

Хімічний склад деяких живильних середовищ наведено в табл. 9.4—9.6.

Середовища Мурасіге—Скуга (MC)і Шенка—Хільдебранд-та (ПІХ) належать до найбільш використовуваних у роботі з куль­турами клітин рослин і виявилися ефективними для росту різних одно- і дводольних рослин. Ixвважають середовищами з високим вмістом солей (у порівнянні з низькосольовим середовищем Уай-та). Середовище ШХ від інших середовищ відрізняється дуже ви­соким, десятикратним вмістом мезоінозиту. Середовища MC і ШХ містять залізо в хелатній формі в комплексі з етилендіамідтетраа-цетатом (ЕДТА). Це забезпечує його доступність при pHдо 8,0про­тягом усього періоду росту культури, тоді як за відсутності харак­теристичного агента нестача може виникнути дуже швидко.

У реактор із мішалкою за допомогою вакууму вносять по черзі приготовлені розчини, дотримуючись такої черговості:

• розчин макросолей;

• агаризований розчин;

Таблиця 9.4 Середовище Мурасіге—Скуга

• розчин феруму хелату;

• розчин мікроелементів;

• розчин кальцію нітрату;

• розчин цукру.

Суміш ретельно перемішують протягом 15хв, потім 1—2хв проводять вертикальне перемішування барботуванням при вклю-

206

207

Таблиця 9.5 Модифіковане середовище Шенка—Хільдебрандта (pH= 6,7)

Таблиця 9.6

Склад інших середовищ, широко використовуваних для культивування клітин рослин

ченій мішалці. Обов'язково відбирають контрольні проби для ви­значення pHсередовища (pHмає бути в межах 5,6—6,2,темпера­тура розчину 152±2,5 °С).

Стерилізація живильних середовищ у промислових умовах здійснюється двома основними методами: періодичним і безпе­рервним.

Періодичний метод стерилізації. Застосовують під час вико­ристання невеликих об'ємів середовища. Він полягає в тому, що середовище, нагріте до певної температури (120—125 °С)безпосе-

208

209

редньо у ферментаторах або в спеціальних парових стерилізато­рах ГПСД-1700, витримується при цій температурі протягом 30— 60хв (залежно від об'єму середовища або від його складу), після чого охолоджується до 27—30 °С.

Безперервний метод стерилізації доцільно застосовувати при використанні великих об'ємів середовища. Приготовлене середо­вище зі спеціальної посудини за допомогою насоса подається в стерилізаційну колону, через яку пропускається гостра пара (тиск пари близько 5атм). Пара подається зверху по внутрішній трубі, яка має щілиноподібні прорізи, завдяки чому пара надходить у середовище і швидко його нагріває. Середовище в колону пода­ється знизу і рухається по спіралі навколо внутрішньої труби.

Нагріте в колоні до необхідної для стерилізації температури (близько 125 °С)середовище надходить у спеціальний аппарат —видержувач, де воно витримується при температурі 120—125 °С.Час витримування залежить від складу середовища (5—10хв.) 3видержувача стерильне середовище надходить у змійовиковий холодильник. Тут воно охолоджується до 30—35 °С(на виході) і надходить у ферментатор. Безперервний метод стерилізації має багато переваг перед періодичним методом: можливість автома­тичного регулювання процесу, швидке і рівномірне нагрівання середовища, забезпечення більш повної стерильності середовища та інші чинники.

Підготовка посівного матеріалу —одна з відповідальних опе­рацій у циклі біологічного методу одержання БАР із культури тканин.

Культуру тканини (колекцію культури) заводу отримують з академій і університетів. Кожна культура має паспорт із доклад­ним описом морфології, фізіології, характеристики середовища для культивування і збереження.

Для твердофазного методу культуру тканини вирощують на агаризованому стерильному живильному середовищі в колбах мі­сткістю 0,25л у термостатованому приміщенні або термостаті з температурою 27±1 °С.Через 38—46діб росту тканину материн­ської культури ріжуть таким чином, щоб інокулюм складався із вертикального стовпа (верхній шар, середній і частина нижнього шару безагаризованого середовища). Не можна допускати дій на культуру деззасобів, бактерицидних ламп, тому що це призво­дить до інактивації росту. 3однієї материнської культури пере­саджують 7—9дочірніх культур і через 38—46діб росту в термо­статованому приміщенні відбирають колби з культурами тканин кращих ростових ознак. Для таких культур характерні швидкий ріст, максимальне використання поживного середовища, колір тка­нини від ясно-жовтого до молочного, відсутність некротичних включень.

Для глибинного (суспензійного) методу культуру тканини по­передньо вирощують на агаризованому стерильному середовищі в пробірці, потім із пробірок висівають у колби з рідким живиль­ним середовищем і проводять дві генерації глибинного вирощу­вання на качалках протягом 38—46діб для кожної генерації. 3другої генерації культури (у колбі) проводять висівання у не­великий (10л) інокулятор, а потім культуру, яка добре розви­вається, переносять в основний ферментатор. Для засівання в основ­ному ферментаторі використовують від 5до 10об'ємних відсотків посівного матеріалу (інокуляту).

9.2.2. БІОСИНТЕЗ БАР (ДРУГА СТАДІЯ)

Стадія біосинтезу —основна біологічна стадія проце­су одержання БАР із культури тканин.

Завдання цієї стадії —забезпечення для продуцента БАР та­ких умов розвитку, які б сприяли максимальному рівню біосин­тезу БАР. Ефективність стадії біосинтезу залежить від рівня утво­рення БАР із культури тканини і визначається генетичними особливостями організму, складом живильного середовища, ре­жимом розвитку продуцента. Вона також залежить від часу мак­симального утворення БАР, вартості компонентів середовища, пі-ногасників і енергетичних витрат, пов'язаних із процесом розвитку організму —продуцента БАР.

Нині виробництво БАР із культури тканин здійснюють двома способами ферментації: культивуванням на поверхні твердого се­редовища (твердофазна ферментація) і зануреним глибинним куль­тивуванням (суспензійне).

Розвиток організму — продуцента БАР у ферментаторах. Про­цес розвитку організму—продуцента БАР у ферментаторах про­ходить за умови суворого контролю всіх стадій, дуже точного ви­конання розробленого регламенту умов нагромадження БАР. Велика увага приділяється підтримці заданої температури куль­тивування, активної кислотності середовища pH, ступеня аерації і швидкості роботи мішалки. 3огляду на споживання організмом основних поживних компонентів субстрату (джерела вуглеводу, азоту, калію, магнію, фосфору, амінокислот, вітамінів) контро­люється утворення БАР.

Особливу увагу під час розвитку продуцента у ферментаторах звертають на процес піногасіння. При продуванні повітря через організм — продуцент БАР часто відбувається густе піноутворен-ня, що суттєво порушує проходження всього процесу розвитку штаму — продуцента БАР у ферментаторі. Основна причина поя­ви великої кількості піни —висока в'язкість живильного середо­вища, обумовлена сильним нагромадженням біомаси.

210

211

Для боротьби з піною у ферментаторах при одержанні біомаси використовують різні поверхнево-активні речовини: рослинні олії (соєву, соняшникову), мінеральні масла (вазелінове, парафінове), спирти і жирні кислоти. Нерідко як піногасники використовують спеціальні синтезовані речовини (силікони, діазобуталкарбоміл та інші сполуки).

Вирощування тканини проводять протягом 70діб. У цей період здійснюють мікробіологічний, біохімічний і візуальний контроль. Візуальний контроль проводять не рідше одного разу в 10днів —відбраковують інфіковані тканини.

9.2.3. ПОПЕРЕДНЯ ОБРОБКА БІОМАСИ (ТРЕТЯ СТАДІЯ)

У процесі розвитку організму —продуцента БАР ці речовини майже повністю виділяються з клітин у навколишнє середовище. Однак у деяких випадках лише частина БАР виділя­ється в культуральне середовище, а інша частина зберігається усе­редині клітин. У деяких продуцентах БАР вони майже повністю містяться в клітинах організму.

Залежно від того, де антибіотична речовина зосереджена, за­стосовують відповідні методи її екстракції.

При твердофазному способі культивування з колби місткістю 0,25л із добре вирощеної культурної тканини спочатку знімають сиру біомасу, потім сушать біомасу на листах при температурі 58±2 °С.Час сушіння біомаси залежить:

• від початкової вологості біомаси;

• товщини шару біомаси;

• температури сушіння.

Закінчення процесу сушіння визначають на дотик. Не повин­но бути м'яких вологих грудок. Суха маса повинна мати забарв­лення від жовтого до коричневого кольору, має бути пухкою, лег­ко розсипатися при продавлюванні між пальцями. Залишкова вологість біомаси після висушування —не більше 12 %.Потім суху біомасу подають на стадію виділення та очищення БАР з аналітичним паспортом на вміст БАР.

При глибинному культивуванні, якщо БАР знаходиться в куль-туральній рідині, її виділяють методами екстракції розчинника­ми, які не змішуються з рідкою фазою, або осаджують у вигляді нерозчинної сполуки, або сорбують іонообмінними смолами.

Виділення БАР із клітин організму-продуцента здійснюють за допомогою екстракції органічними розчинниками. Якщо БАР містяться в культуральній рідині та в клітинах продуцента, пер­винною операцією їх виділення є переведення у фазу, з якої най­більш доцільно їх ізолювати. Для цього БАР, яка міститься в куль-

212

туральній рідині і в клітинах продуцента, переводять в осад, а потім її екстрагують.

Відділення нативного розчину від біомаси і завислих части­нок проводять методами фільтрації або центрифугування.

Для процесу фільтрації використовують різні фільтрувальні апарати: фільтрпрес, нутч-, друк-фільтри, центрифуги, сепаратори.

Фільтрпреси використовують для обробки великих об'ємів культуральної рідини. Ці апарати складаються із плит і рам, що чергуються, і фільтрувальних перегородок між ними. Процес фільтрації здійснюється під тиском. Для фільтрації невеликих об'ємів культуральної рідини звичайно використовують нутч-, друк-фільтри. Перший апарат працює під вакуумом, другий —в умовах підвищеного тиску над рідиною, що фільтрується.

Для одержання рідини, звільненої від завислих частинок, най­більшого поширення набув метод центрифугування. Хороші ре­зультати досягаються при правильному виборі швидкості подачі рідини (кращий варіант — 15 000об/хв).

Відділення міцелію або інших завислих частинок може також відбуватися в сепараторах. При швидкості обертання барабана, яка дорівнює 7000—7500 об/хв, завдяки відцентровій силі тверді частинки спрямовуються до стінок барабану, де й осаджуються, а відсепарована рідина спрямовується до центра барабана і підні­мається в спеціальні камери.

9.2.4. ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИЩЕННЯ БАР (ЧЕТВЕРТА СТАДІЯ)

У процесі утворення БАР у біомасі (твердофазний спосіб культивування) і в культуральній рідині (глибинний спосіб культивування) разом із різними невикористаними компонента­ми середовища виділяються і різноманітні продукти обміну, про­дукти автолізу клітин. Видалення домішок —перша і дуже важ­лива стадія хімічного очищення БАР.

Стадія виділення і хімічного очищення включає низку проце­сів: від обробки нативного розчину до висушування готового очи­щеного препарату. На цій стадії, залежно від властивостей БАР, їх хімічної будови і місця основного накопичення застосовують різні методи виділення та очищення. Як основні методи застосо­вують екстракцію в системах рідина—рідина, екстракцію осаджен­ня, сорбцію на різних сорбційних матеріалах, мембранні методи очищення, кристалізацію, упарювання, висушування.

Однією з особливостей стадії виділення і очищення є те, що під час виділення БАР доводиться працювати з дуже невисокими концентраціями речовин, що виділяються, (не перевищують 2 %).

213

Мета очищення —витягування БАР із нативної рідини або з клітин продуцента, їх концентрування і звільнення (власне очи­щення) від супутніх домішок і нарешті одержання добре очище­ного препарату, придатного для відповідного застосування.

БАР рослинного походження у деяких випадках під дією жорст­ких зовнішніх чинників (підвищеної температури, високої кислот­ності або лужності і т. ін.) втрачають свої властивості; інактиву-ються. Тому їх виділення та очищення необхідно проводити дуже обережно.

9.2.5. ОДЕРЖАННЯ ГОТОВОЇ ПРОДУКЦІЇ (П'ЯТА СТАДІЯ)

Відомо, що до БАР біотехнологічного походження, що використовуються у медичній практиці, висувають дуже висо­кі вимоги:

• високий ступінь очищення;

• фармакологічна активність;

• стерильність.

Тому на цій стадії роботи, а також під час хімічного очищення препарату необхідно дотримуватися високого ступеня чистоти: підтримувати у надзвичайній чистоті не тільки використане облад­нання, але й приміщення, де проходить біосинтез.

Після виділення і хімічного очищення БАР її необхідно вису­шити —видалити з препарату вільну і зв'язану воду. Оскільки деякі БАР, отримані за цією технологією, у тому або іншому сту­пені термолабільні, для їх висушування необхідно застосовувати методи, які не призведуть до втрати біологічної активності і не змінять кольору препарату. На сучасному етапі одержання БАР застосовують різні методи зневоднювання препарату. Крім зви­чайних методів сушіння, широкого поширення набуло ліофільне висушування БАР, що проводиться при порівняно низьких тем­пературах (від -8до -12 °С).

Прогресивним методом при роботі з великою кількістю розчи­ну, що містить БАР, є висушування із застосуванням розпи­лювальних сушарок. Розчин БАР пневматично розпилюється до дрібних крапель у камері потоком нагрітого повітря. Процес вису­шування БАР проходить протягом кількох секунд. При цьому на­віть термолабільні речовини не змінюють своїх властивостей.

Фасування порошків проводять в основному в посудини, виго­товлені із оранжевого скла.

Готовий порошок піддається ретельному аналітичному, біоло­гічному і фармакологічному контролю.