8.6. Гідрофобна хроматографія

Метод гідрофобної хроматографії застосовують для розділення БАР на основі гідрофобних властивостей, характер­них для біологічних об'єктів.

В основі механізму селективності при гідрофобній хромато­графії лежить виявлення так званого гідрофобного ефекту, а та­кож модуляція електровалентних взаємодій, унаслідок зменшен­ня локальної діелектричної сталої середовища при введенні неполярних радикалів або зниженні активності розчинника.

Гідрофобна хроматографія реалізується у вигляді декількох різних процесів. Найчастіше сорбція амфільних сполук гідрофоб-

184

185

ними сорбентами здійснюється з розведених водних розчинів при низьких значеннях pH середовища (2,0—4,0), а елюація — зни­женням так званої елюатропної сили рухомої фази, що досягаєть­ся зміною pH, зменшенням полярності елюенту (при додаванні спиртів, детергентів та інших органічних модифікаторів). Цей вид хроматографії одержав назву зворотнофазної (ЗФХ).

При введенні в розчин амфільних сполук, здатних вступати у взаємодію з менш роздільними гідрофобними компонентами, останні все ж можна розділити.

Таким методом на неполярних сорбентах удається розділити навіть іонізовані сполуки, якщо додати в розчин протилежно за­ряджені амфільні сполуки, здатні утворювати іонні пари з дослі­джуваними компонентами. Цей вид хроматографії був названий іон-парною зворотнофазною хроматографією.

Гідрофобна взаємодія реалізується також і при так званій ви-солювальній хроматографії (BX), яку часто називають хромато­графією гідрофобних взаємодій, основний принцип якої полягає в сорбції амфільних сполук із водних розчинів при великій кон­центрації солей з подальшою елюацією сольовими розчинами з більш низькою іонною силою або водою. Іноді елюацію здійсню­ють таким способом, що одночасно зі зменшенням концентрації солі підвищують концентрацію гідрофобного витисника. Як у зво-ротнофазній, так і висолювальній хроматографії можуть викори­стовуватися ті самі типи сорбентів із пришитими неполярними радикалами.

8.6.1. СОРБЕНТИ ДЛЯ ГІДРОФОБНОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

При проведенні гідрофобної технології слід врахову­вати фізико-хімічні параметри сорбентів: пористість, питому по­верхню, гідрофільні і гідрофобні властивості, хімічну стабільність, інертність, проникність. Усім цим вимогам відповідають зворот-нофазні гідрофобні сорбенти і макропористі гетерогенні полімерні сорбенти типу солоза K 30/40, K 20/40, K 10/40, КГ 8/40, гідро­фобні властивості яких виражені більш слабко, ніж у зворотно-фазних сорбентів.

Поверхня кремнеземних сорбентів містить велику кількість силанольних (SiOH) і силоксанових груп (Si—0—Si), a також не­велику кількість домішок оксидів металів (табл. 8.2). Найбільшу хімічну однорідність мають аеросилогелі (силохроми), одержані спіканням частинок непористого високодисперсного силіцію ді-оксиду — аеросилу.

Різні модифікації методів ЗФХ широко застосовують для очи­щення пептидів, таких, як окситоцин, ліпресин, АКРГ і його по-

Таблиця 8.2 Деякі типи кремнеземних сорбентів для ЗФХ біологічно активних речовин

хідних, пептидногогормону росту —соматотропіну, пептидних антибіотиків, лейкоцитарного інтерферону, для розділення висо-комолекулярних білків (хімотрипсиногену, феритину та ін.).

Використання гідрофобної хроматографії зручне і при роботі з висококонцентрованими розчинами. Так, розчин амонію суль­фату в концентраціях, дещо нижчих за необхідні для висолюван­ня білка, сприяє зв'язуванню білків із гідрофобними гелями. Ви­сока концентрація солі знижує розчинність білків і збільшує їх здатність взаємодіяти з неполярною поверхнею сорбенту. Фракці­онування зв'язаних білків часто досягається зниженням полярно­сті елюенту (наприклад, за допомогою поліетиленгліколю).

186

187

Таблиця 8.3 При використанні

Іон-парні агенти іон-парних агентів дося-

гається додаткове поси­лення селективності зво-ротнофазних адсорбентів при розділенні білків, олігопептидів та інших БАР.

У табл. 8.3наведений список катіонних і аніон­них амфільних сполук, що використовуються як іон-парні агенти. При доборі умов розділення суміші білків при ЗФХ обов'язко­во враховують pH розчину, в'язкість і температуру.

8.7. АФІННА ХРОМАТОГРАФІЯ

Цікавим хроматографічним методом є афінна хро­матографія, заснована на нативній специфічності деяких біопо-лімерів, особливо якщо вони містяться в культуральній рідині в невеликих концентраціях — менше 1 мкг/мл. У цьому методі хороше розділення досягається за рахунок специфічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною.

Між афінною хроматографією і іншими більш традиційними методами адсорбційної або іонообмінної хроматографії існують значні відмінності. У традиційних хроматографічних методах спо­чатку адсорбуються всі компоненти суміші, а їх розділення здій­снюється на стадії десорбції за допомогою, наприклад, заміни концентрації елюенту або концентрації солей у елюенті, або по­ступового підвищення pH елюенту. Навпаки, специфічність афін­ної хроматографії визначається в основному на стадії сорбції (рис. 8.3). Тому в афінній хроматографії через колонку доцільно

пропускати розчин суміші, яка розділяється протягом досить три­валого проміжку часу, поки не буде досягнуте насичення нерухо­мої фази, тому що в ній адсорбуються практично тільки сполуки, що виділяються. Таким чином, проведення розділення БАР в афін­ній хроматографії наближається до звичайної сорбції в нерухомо­му шарі аж до насичення шару адсорбенту і різко відрізняється від звичайного розділення багатокомпонентної суміші, яку вво­дять у колонку одноразово у вигляді концентрованого розчину.

У цьому методі хороше розділення досягається за рахунок спе­цифічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною. Показано три стадії: уведення суміші речовин а, роз­ділення б; елюювання, зв'язане з нерухомою фазоюкомпонента суміші в.

8.7.1. СОРБЕНТИ ДЛЯ АФІННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

Сорбентами для афінної хроматографії, як правило, є полімери, що використовуються для гельпроникної хроматогра­фії після цілеспрямованої модифікації (агарози, поліакриламіди, целюлози, пористі стекла).

Найважливіший параметр при модифікації вихідних мат­риць —об'ємна концентрація, що відповідає угрупованню^ і яке, як правило, вибирається емпірично. Другий найважливіший пара­метр _ стабільність нанесеного афінату в процесі сорбції — елюа-ції. Якщо афінатами є білки, наприклад, поліклональні або моно-клональні антитіла, білкові і пептидні інгібітори, то стабільність шару афінату можна підвищити, проводячи додаткову міжмолеку­лярну зшивку. Концентрацію зшиваючого агента (наприклад, глу-тарового альдегіду) слід вибирати з урахуванням потреби уникну­ти істотної зміни конформації зшитих білків, що часто призводить до втрати афінату.

При виборі вихідного сорбенту доводиться приділяти увагу скороченню розмірів доступних зон у порах після введення в них протяжливих афінатів. Тому матриці для біоспецифічної хрома­тографії з об'ємними афінатами повинні мати діаметри пор, які перевищують у 3—5 разів суму хроматографічних діаметрів мак­ромолекул комплексів антиген—антитіло, білок—інгібітор і т. д.

При використанні білків як афінатів слід враховувати гетеро­генність сорбційних центрів, зумовлену такими чинниками, як гетерогенність білків до приєднання, вплив протеаз і денатурації, зміна структури і властивостей афінатів у процесі приєднання, а також у процесі розділення. Цей чинник виявляється особливо суттєвим з погляду впливу навантаження на колонку як при сорб­ції, так і при виборі умов десорбції.

Суть методу біоспецифічної хроматографії полягає в тому, що між одним або обмеженим числом білків-ферментів із множини

188

189

наявних у суміші, яка фракціонується, і полімерним сорбентом утворюється досить стабільний зв'язок, у результаті чого ці білки з розчину переходять на нерозчинний сорбент, що підвищує його селективність.

Висока селективність біоспецифічних сорбентів забезпечуєть­ся тим, що як ліганди використовуються речовини, які специфіч­но взаємодіють з активним центром ферменту, що виділяється. Центром зв'язування служать субстрати, що приєднуються до по­лімерних матриць, їх аналоги, оборотні інгібітори, коферменти, антитіла та інші речовини, так звані ліганди.

Таблиця 8.4 Приклади спорідненості біологічних молекул

За своєю природою афінна хроматографія є варіантом адсорб­ційної хроматографії і її основних закономірностей, близьких зво-ротнофазній та іншим видам адсорбційної хроматографії. Вико­ристовуючи рівняння

можна показати, що утримування БАР відбувається тільки за умови [Р₀] >K_D, коли концентрація іммобілізованого афінату [Р₀] більше константи дисоціації комплексу фермент—афінат, напри­клад, відносне утримування V_e = V_Q = 10при [PJ= 1 ммоль/лможливо при розмірі константи дисоціації K_D * 10"⁴моль/л. Оче­видно, що при використанні афінатів з більшою величиною K_D необхідно підвищувати концентрацію іммобілізованого афінату. Навпаки, при використанні афінатів із дуже малими величинами K_D можна одержати ефективно утримувальні сорбенти навіть при невеликих концентраціях афінатів.

• великопористість гелевої структури;

• гідрофільність, що забезпечує добру взаємодію її з водою і відсутність неспецифічного зв'язування білків з гідрофобними центрами;

• відсутність в структурі заряджених груп;

• здатність полімера легко активуватися певними хімічними агентами.

Зазначеним вимогам відповідають: синтетичні полімери —поліакриламіди, сферони, а також великопористе скло і силіка­гелі.

Звичайно хроматографічний процес складається з послідовно мінливих етапів сорбції, видалення несорбованих білків і елюації сорбованих ферментів.

Великі перспективи відкриває використання багатоклональ-них антитіл для приготування афінних гелів. Досить 4—5 анти­тіл, щоб приготувати 1 л афінного гелю. Такі гелі успішно вико­ристовують для виділення із середовища культивування тваринних клітин, наприклад, гормону росту людини — самототропіну та інтерферону.

Спрямований синтез біоспецифічних сорбентів і вибір режи­мів афінної хроматографії дозволяє домогтися таких високих сту­пенів очищення БАР, які недосяжні для інших хроматографіч­них прийомів. За одну стадію ступінь очищення може досягати 10²—10³ разів.

8.8. ЕЛЕКТРОФОРЕЗ

Електрофорезом називають розділення БАР завдя­ки різній швидкості її переміщення в електричному полі. Постій­на швидкість U досягається частинкою із зарядом q, у рідкому середовищі під впливом електричного поля з напруженістю E, визначається балансом

Оскільки взагалі кожний білок має свій власний, результую­чий заряд, то накладення електричного поля призводить до того, що різні білки рухаються з різними швидкостями. Таким чином суміш декількох білків можна розділити на індивідуальні компо-

190

191

ненти. За допомогою зміни рН можна регулювати електрофорети­чну рухомість білка. Якщо p/окремого білка менше рН середови­ща, то його заряд і швидкість будуть негативними. Навпаки, біл­ки з pI > рН рухатимуться в позитивному напрямі. Цей принцип покладений в основу одного з методів визначення pJ білків та інших речовин; у градієнті рН p/ білка дорівнює рН, при якому його електрофоретична рухомість U_e дорівнює нулю.

У методі електрофорезу в потоці рідка фаза рухається перпен­дикулярно напряму електричного поля, що дозволяє здійснювати безперервне розділення. При електрофорезі в гелі на рух молекул БАР впливають процеси адсорбції і десорбції, а також опір дифузії.